熒光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中的應用價值

王華先

熒光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中的應用價值

王華先

目的探討熒光原位雜交技術(FISH)及染色體核型分析在產前診斷中的臨床應用價值。方法 抽取90例婦產科就診孕婦的羊水進行體外培養并進行染色體核型分析, 其中對45例羊水樣本應用熒光原位雜交技術, 直接對間期核細胞進行13、18、X、Y等染色體數目進行檢測。結果 90例羊水樣本有88例樣本完成染色體核型分析, 診斷成功的幾率為97.78%, 其中2例患者出現異常染色體核型的情況, 占2.22%, 報告的時間平均為(23.49±5.11)d。在應用熒光原位雜交技術的45例樣本中, 診斷成功的幾率為100.00%, 其中有8例患者出現異常染色體核型的情況, 占8.89%, 其中, 結構異常5例,數目異常3例。另外, 在染色體數目的診斷上, 熒光原位雜交技術與染色體核型分析的診斷結果一致,平均報告的時間為(2.78±4.13)d。結論 熒光原位雜交技術應用于產前診斷中具有成功率、準確性高的特點, 能夠有效縮短報告的時間, 但是對于某些情況特殊的患者來說, 單純地使用熒光原位雜交技術則有可能造成漏診的現象發生, 因此熒光原位雜交技術并不能完全取代染色體核型分析技術, 在必要時需要同時使用兩種技術。

熒光原位雜交技術；染色體核型分析；產前診斷；臨床應用價值

為了探討光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中的臨床應用價值, 本院特進行了一次研究, 取得了較為良好的效果, 現將具體情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取梅州市人民醫院婦產科就診的孕婦90例作為研究的主要對象, 年齡最小19歲, 最大47歲, 平均年齡(32.74±5.87)歲, 高齡孕婦(年齡≥52歲)18例、血清學篩查異常20例、Down’s高風險16例、胎兒畸形17例、不良孕產史19例。

1.2 診斷方法 本次研究中所需要用到的儀器有：染色體核型分析系統、熒光原位雜交(FISH)分析系統、熒光顯微鏡、雜交儀、電熱恒溫水浴箱、普通低速離心機、二氧化碳恒溫培養箱、微量加樣器等。

抽取所有孕婦的羊水進行體外培養并進行染色體核型分析, 其中對45例羊水樣本應用熒光原位雜交技術。在B超定位的引導下, 經腹部性羊膜腔刺穿術, 抽取羊水35 ml, 其中30 ml羊水用于細胞培養, 5 ml羊水準備FISH實驗, 羊水細胞離心后放置在無菌玻璃試管內備用。以下是熒光原位雜交技術的相關步驟。

1.2.1 制備樣本玻片 取2～5 ml羊水, 2000 r/min , 離心10 min,去上清制成細胞懸液, 留沉淀0.2 ml。在離心管中加入5 ml預溫的0.075 mol/L KCl, 并且在37℃水浴中低滲30 min。離心10 min后去上清, 加入用甲醇和冰醋酸新配制的固定液兩者的比例為3∶1, 進行10 min的預固定, 重復上述離心步驟,重復固定2次, 10 min/次。讓滴片自然干燥后放置在-20℃冰箱進行保存。

1.2.2 進行變性雜交 主要的過程為：選擇13號、18號、21號、X、Y染色體特異性探針。將按照上述步驟制備好的羊水、絨毛玻片自冰柜中取出, 依次放入70%、85%、100%乙醇中進行脫水處理。用10 μl橘紅色的探針在玻片的雜交區域滴加混合物, 并且在靶區域蓋上蓋玻片, 避免產生氣泡。值得注意的是, 這一系列的過程需要在暗室中操作。最后用橡膠泥將蓋玻片封好, 放置在37℃的暗濕盒中雜交16 h［1］。

1.2.3 進行玻片的洗滌工作 去掉蓋玻片, 用SSC溶液進行漂洗、乙醇漂洗。另外需要在暗室中將其進行自然風干,并且加6 μl DAPⅡ復染。在靶區域加蓋玻片。

1.2.4 對結果進行觀察 應用熒光顯微鏡, 激發光濾片、圖像分析系統在鏡下觀察雜交效果。細胞雜交率在80%以上為有效標本。另外, 在判定的過程中需要注意細胞核膜是否完整。在細胞核內可見清晰明亮的桔紅色熒光信號, 需要根據熒光點直接的大小來記錄數量。例如, 出現2個或3個熒光點, 并且2個位點之間距離＞單個信號的直徑以上, 熒光強度相近, 計為含有2 條或3 條染色體。兩個信號之間的距離＜1個信號的直徑則計數為1 條染色體。記錄雜交信號數目并錄入圖像分析儀。

1.3 觀察指標 觀察13、18、X、Y等染色體數目、報告平均時間和診斷的成功幾率。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 診斷的成功幾率 90例羊水樣本有88例樣本完成染色體核型分析, 診斷成功的幾率為97.78%。應用熒光原位雜交技術的45例樣本中, 診斷成功的幾率為100.00%。

2.2 異常核型出現情況 染色體核型分析中2例患者出現異常染色體核型的情況, 所占的比例為2.22%, 熒光原位雜交技術中8例患者出現異常染色體核型的情況, 所占的比例為8.89%, 結構異常的有5例, 數目異常的有3例。

2.3 報告的時間比較 染色體核型分析報告的時間平均為(23.49±5.11)d, 熒光原位雜交技術平均報告的時間為(2.78± 4.13)d。

3 討論

熒光原位雜交技術簡稱為FISH, 是近幾年根據發展的需要而出現的一種診斷新方式, 主要的原理是利用其特殊的探針進行DNA雜交, 經免疫熒光顯色后檢測細胞內特異DNA是否存在［2］, 適用的范圍較為廣泛, 但主要應用于檢測染色體中期分裂相和未培養細胞間期核是否異常。這一方式能夠在產前對孕婦進行快速診斷, 能在孕早期識別胎兒的嚴重先天缺陷, 診斷的情況主要為高齡孕婦、血清學篩查異常、Down’s高風險、胎兒畸形、不良孕產史等［3］。

染色體核型分析是傳統的產前診斷方式, 也是臨床中應用最多、效果最為穩定、準確率較高的方式之一, 既能夠檢測染色體是否出現數目異常的現象, 又能夠達到檢測染色體結構異常的目標, 被醫學界稱為“金標準”［4］。但是由于染色體核型分析是建立在羊水細胞體外培養的基礎上, 體外培養耗時較多, 成為了主要弊端［5］。而熒光原位雜交技術這種新方式的出現有效地避免了這一弊端, 真正實現了對DNA片段的定量和定位分析。本次研究中, 本院采用了熒光標記探針對13、18、X、Y等染色體的數目進行了檢測, 平均報告所需要的時間明顯短于染色體核型分析。但是在本次研究中也發現了此種技術的缺陷, 即高齡產婦在應用FISH技術時具有較大的風險, 漏診的幾率將會達到0.5%。

綜上所述, 熒光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中具有極強的臨床應用價值, 這一方式值得在臨床中大力推廣應用。

［1］ 趙煒, 俞冬熠, 張凱.羊水細胞培養及熒光原位雜交技術在產前診斷中的應用.中國優生與遺傳雜志, 2013, 21(4):57-59.

［2］ 柳宛璐, 喬福元, 唐紅菊, 等.熒光原位雜交技術在產前診斷中的應用價值.中國實用婦科與產科雜志, 2013, 29(3):197-199.

［3］ 姜淑芳, 盧彥平, 付玉榮, 等.染色體熒光原位雜交快速產前診斷染色體數目異常.解放軍醫學院學報, 2013, 34(8):808-810, 813.

［4］ 黎青.DMD基因診斷體系建立、應用和羊水iPSCs構建.南方醫科大學, 2013.

［5］ 朱義保, 劉艷秋, 李宇中, 等.熒光原位雜交技術在未培養羊水細胞產前診斷中的應用研究.實用婦產科雜志, 2011, 27(1): 46-48.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.12.057

2014-12-22］

514089 廣東梅州市人民醫院檢驗科