RhoA在乳腺癌中表達的研究

劉永智

RhoA在乳腺癌中表達的研究

劉永智

目的 探討RhoA在人乳腺癌中表達的情況及其意義。方法 免疫組化S-P法和Western blot方法檢測乳腺癌以及良性乳腺疾病組織中RhoA蛋白的表達情況。結果 ①RhoA蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達明顯優于乳腺良性疾病組織中的表達, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。 ②病理組織學分級(SBR分級)、淋巴結轉移的有無與RhoA蛋白在乳腺癌中表達有關, 與患者年齡、腫瘤大小和臨床分期無關。結論 RhoGTPase家族成員RhoA蛋白在乳腺癌中的高表達說明其與乳腺癌的發生、發展的臨床效果關系密切。為深入研究和使用RhoA抑制劑抑制乳腺腫瘤發生和發展的臨床過程提供實驗依據。

RhoGTPase；RhoA；乳腺癌

惡性腫瘤的重要特征是侵襲和轉移, 這些特征也是患者死亡的主要原因。隨著對腫瘤轉移基因調控的多階段、多因素、多步驟理論的研究不斷跟進, 對于這一復雜病理過程有了更深入的認識。在人體腫瘤中, RhoA蛋白的異常表達使腫瘤細胞運動能力增強并促進其遷徙, 因此與腫瘤的發生、發展密切相關［1］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月～2014年6月期間在本院接受手術的女性患者120例。其中完整的乳腺癌蠟塊標本60例、良性乳腺疾病標本蠟塊20例, 手術切除的乳腺癌新鮮組織標本20例、良性乳腺疾病新鮮組織標本20例, 存放于-80℃冰箱凍存。年齡26～79歲, 平均年齡49歲。所有患者術前均未做放療、化療和內分泌治療。乳腺癌標本均經病理證實為浸潤性導管癌。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測采用免疫組織化學SP法。RhoA多克隆抗體購于Santa Cruz公司、ALP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗體、S-P試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。嚴格按照說明書操作(一抗稀釋度：RhoA 1：100)。

1.2.2 Western Blot 檢測手術切除的組織塊加入裂解液裂解后離心取上清。向樣品中加入500 μl RIPA緩沖液(1%NP-40, 5%脫氧膽酸鈉, 5%SDS, 0.1%PMSF),離心取上清。考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度, 準確吸取50 μg蛋白質, 100 V電泳至溴酚藍出膠。將凝膠貼于PVDF膜上, 25 V轉印30 min, 5%脫脂奶粉封閉液中搖床過夜, 加入1：1000稀釋的一抗搖床上雜交2 h, 加入1：5000稀釋的二抗搖床雜交, 漂洗后顯色。應用Chemi-Genius凝膠分析系統分析條帶灰度值。

1.3 結果判斷標準 由病理科醫師協助免疫組化結果判定。RhoA蛋白的表達呈彌漫性棕黃或棕褐色顆粒多呈現在乳腺癌的細胞質。大多數良性乳腺疾病的細胞質內未見或少見這種著色。癌細胞的每張切片先在低倍鏡下觀察, 這樣可確定癌組織部位, 然后再在高倍鏡下觀察, 每張切片隨機的選擇10個高倍視野, 輸入細胞圖像分析系統, 記錄陽性細胞的個數, 并計算陽性細胞百分率。RhoA蛋白陽性細胞可見細胞質顯示棕黃或棕褐色, 判定標準是以陽性細胞數＜10%定為陰性(-), 陽性細胞數≥10%定為陽性(+)。

1.4 統計學方法 數據分析使用SPSS17.0統計學軟件。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Western Blot檢測RhoA蛋白在乳腺組織中的表達 RhoA蛋白在20例良性乳腺疾病組織中呈低表達, 灰度值為(36625.34±562.20),在20例乳腺癌組織中呈高表達, 灰度值為(59634.78±184.44)。RhoA蛋白在乳腺癌組織中的表達值顯著高于良性乳腺疾病組織, 且差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 免疫組化法測定RhoA蛋白在乳腺癌組織和良性乳腺疾病組織中的表達情況 RhoA在良性乳腺疾病組織中呈低表達(41%), 乳腺癌中呈高表達(76%)。RhoA蛋白在乳腺癌組織中表達的陽性率顯著高于良性乳腺疾病組織, 差異明顯,且具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤轉移高度相關的基因的發現及證實, 已經成為當前腫瘤轉移機制研究的熱點, 原因是這些基因及其產物是一種重要的研究癌細胞的指標, 對治療癌癥患者具有重要意義。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被發現的一種能克隆的一種蛋白, 它們的相對分子質量大約為20～25 kD, 并與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)結合而成的蛋白, 具有GTP酶活性, 也可稱為Rho GTP酶。RhoA是Rho亞家族的成員, 主要參與張力纖維形成和粘著斑復合體(focal adhesion complexs, FACs)組裝［2］。

Rho GTP酶的工作原理和Ras超家族的其他成員一樣,就是羧基端通常具有共同結構域。Rho GTP酶經翻譯后修飾,這樣的Rho GTP酶才具有活性, 才可能與細胞膜上適宜的脂質分子結合, 發揮其作用。Rho GTP酶是細胞內信息傳播的介質, 在細胞內的信號轉導中發揮橋梁作用。如在RhoA/ ROCK-2細胞通路中, 在血管內皮生長因子VEGF-C的參與下, 可促進宮頸癌的侵襲和轉移［3］。Rho GTP酶還可調節正常細胞的增殖、分化、凋亡, 并關系到腫瘤的發生和轉移。通過實驗研究發現, Rho GTP酶的異常表達可在多種腫瘤中發現, 細胞內Rho GTP酶的表達的改變直接影響到腫瘤細胞的侵襲和轉移?；罨腞hoA可促進骨肉瘤的轉移［4］。Rho GTP酶中尤其是RhoA是關鍵的調控因子, 主要參與對細胞形態改變, 細胞與基質粘附及細胞骨架重組的調控, 調節腫瘤細胞的侵襲轉移過程［5］。GTPases的羧基甲基化和等離子體膜易位可以通過葉酸進行調節, 研究表明缺乏葉酸會導致這些蛋白質保留在內質網, 減少肺癌細胞的侵襲和轉移。非活化(GDP-bound) GTPases向活化的(GTP-bound)GTPases導致下游激酶的活化, PAK、 LIMK和肌動蛋白的磷酸化過程中葉酸起到一定的作用, 其作用通過 RhoA 和Rac1進行,但不是Cdc42。通過針對RhoA或Rac1做為靶點可阻斷葉酸對磷酸化和細胞遷移和入侵的影響, 進一步控制惡性腫瘤的發展。

RhoA參與癌癥發生、發展的重要環節, 是關鍵的調控因子, RhoA可以成為腫瘤藥物開發的新靶位, 并且針對RhoA進行的腫瘤治療很有可能減少傳統抗癌藥物的副作用,對于腫瘤的臨床治療將具有良好的應用前景。

［1］ Senoo H, Iijima M.Rho GTPase: A molecular compass for directional cell migration.Senoo H, Iijima M.Commun Integr Biol, 2013, 6(6):27681.

［2］ Makrodouli E, Oikonomou E, Koc M, et al.BRAF and RAS oncogenes regulate Rho GTPase pathways to mediate migration and invasion properties in human colon cancer cells: a comparative study.Mol Cancer, 2011, 23(10):118.

［3］ He M, Cheng Y, Li W, et al.Vascular endothelial growth factor C promotes cervical cancer metastasis via up-regulation and activation of RhoA/ROCK-2/moesin cascade.BMC Cancer, 2010, 29(10):170.

［4］ Chiappetta C, Leopizzi M, Censi F, et al.Correlation of the Racl/ RhoA Pathway With Ezrin Expression in Osteosarcoma.Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2014, 22(3):162-170.

［5］ Li H, Peyrollier K, Kilic G, et al.Rho GTPases and cancer.Biofactors, 2014, 40(2):226-235.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.031

2014-10-10］

117000 遼寧本溪本鋼總醫院乳腺外科