乳腺癌新輔助化療前后相關miRNA差異表達研究

謝小紅 顧錫冬 趙虹 洪日 胡袁媛 許雷來

乳腺癌新輔助化療前后相關miRNA差異表達研究

謝小紅 顧錫冬 趙虹 洪日 胡袁媛 許雷來

目的 探究乳腺癌新輔助化療療效新的評價指標。方法 定量PCR分析15例采用FEC方案化療的乳腺癌患者化療前后乳腺癌組織中miR-125、miR-145、miR-155、miR-210、miR-203以及miR-let-7的表達情況。結果 與化療前比較，患者化療后miR-125、miR-155、miR-203以及miR-let-7表達水平差異均無統計學意義（均P＞0.05），但化療后miR-145表達水平升高而miR-210下降，與化療前比較均有統計學差異（均P＜0.05）。結論 FEC方案治療后，患者乳腺癌組織內miR-145表達水平顯著升高而miR-210表達水平顯著下降，可能與患者化療效果相關。miR-145和miR-210可能可以用于化療效果的預測。

乳腺癌 新輔助化療 miRNA miR-145 miR-210

美國癌癥協會發布的癌癥統計預期數據顯示，乳腺癌的發病率居于女性惡性腫瘤的首位，全球每年約有120萬婦女患乳腺癌，占所有女性新發惡性腫瘤的29%。我國北京、上海等大城市的統計結果顯示乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，發病人數每年新增3%~4%，超過世界水平的1%~2%[1]。據《浙江省腫瘤登記地區2010年癌癥發病與死亡分析》[2]報道，浙江省乳腺癌發病率47.80/10萬，高于全國水平，嚴重威脅著女性的健康和生命。雖然隨著診療技術的進步，早期乳腺癌的檢出率已經大幅提高，但是臨床上局部晚期乳腺癌仍然常見。對于這部分患者，新輔助化療是目前公認的最有效的治療方法，而目前臨床上對于新輔助化療的效果評判主要還是依靠臨床體檢和影像學判斷，缺乏更科學的判斷標準。

miRNA是長約20~24nt的小單鏈非編碼RNA，在人體中廣泛參與一系列生理過程的調控，包括器官發育[3]、細胞分化[4]、免疫反應[5]和腫瘤形成[6]等。通過文獻復習，筆者選擇了6個與乳腺癌相關性較強的miRNA作為研究目標，希望通過觀察化療前后患者乳腺癌組織中miRNA的變化，試圖為新輔助化療尋求新的療效指標。

1 資料和方法

1.1 一般資料 篩選2013年4月至2014年2月于本院初診的乳腺癌患者15例，均為女性，年齡32~68歲，平均50.5歲；TNM分期在Ⅲa以上。患者術前均行粗針穿刺組織活檢，病理診斷為乳腺浸潤性導管癌。診斷明確后予FEC方案化療3個周期，臨床評估均達部分緩解（PR）后行手術治療，術中留取腫瘤組織。入組患者化療前后的病理組織均取自臨床癌腫中心區域（癌腫核心區），標本大小約1cm3，置于凍存管中，液氮速凍之后轉移至-80℃冰箱保存。化療采用中心靜脈注射，方案為FEC方案，具體為：環磷酰胺500mg/m2d1+表柔比星100mg/m2d1+5-氟尿嘧啶（5-Fu）500mg/m2d1，21d為1個化療周期；其中表柔比星最高劑量不超過140mg/次。化療3個周期后所有患者均順利接受手術治療。

1.2 主要試劑 5mg/ml溴化乙錠（EB）、50×TAE核酸電泳緩沖液母液、DEPC水、EDTA和Tris購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，固相RNase清除劑為北京天恩澤基因科技有限公司產品。環磷酰胺注射液由浙江海正藥業股份有限公司生產（批號：04150603），表柔比星由輝瑞制藥（無錫）有限公司生產（批號：L62525），5-Fu由武漢欣欣佳麗生物科技有限公司生產（批號：1404141）。SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）為日本Takara公司產品，Rever-Tra-Ace-α-Transcriptase為東洋紡（上海）生物科技有限公司產品。

1.3 定量PCR檢測 手術前穿刺獲取患者腫瘤中心部位的乳腺癌組織，化療后進行腫瘤切除手術時再次取患者腫瘤中心部位的組織樣本。以Trizol試劑提取總RNA，選取OD260/OD280為1.9~2.0，28S rRNA/ 18S rRNA為1.8~2的樣品進行定量PCR。首先對RNA樣品進行PolyA加尾，37℃反應15min后立即使用或者-80℃保存。采用Rever-Tra-Ace-α-Transcriptase進行逆轉錄，逆轉錄上游引物序列如表1，所需引物由英濰捷基公司和生工生物公司合成。下游引物序列為錨定引物序列（序列專利保密）。U6作為內參基因，擴增效率1.95~2.05，熔解曲線為單峰（見圖1），無引物二聚體。逆轉錄反應完成后，采用SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進行定量PCR反應。所有的反應重復3次。結果處理按照2-ΔΔCT法：首先計算出每個標本目的基因及內參基因U6的Ct值，ΔCT=Ct（目的基因）-Ct（U6），再按照ΔΔCT=ΔCT（化療前）-ΔCT（化療后）計算出化療前后各目的基因表達的差異[7]。

1.4 統計學處理 應用Origin software 9.0和Excel software統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用Student t檢驗。

2 結果

對比15例乳腺癌患者化療前后腫瘤原發部位的miRNA表達水平發現，化療后miR-145表達水平明顯升高而miR-210表達明顯下降（均P＜0.05），而其余幾項miRNA表達水平與化療前比較均無統計學差異（均P＞0.05），見表2。

表1 定量PCR所需引物

表2 患者化療前后相關miRNA表達比較

3 討論

miRNA雖然發現較晚，但2005年以后大量的研究將miRNA引入腫瘤研究的領域。miRNA調控腫瘤形成和發展的機制逐漸被人們揭示而且成為了腫瘤治療的靶點。同時，越來越多的研究表明miRNA可以作為獨立的預后因子預測腫瘤的惡性程度以及預后。

本研究中筆者試圖研究miRNA作為新輔助化療效果的“指示劑”的可能性。結果發現，15例患者化療后都呈現miR-145上調。miR-145原本是抑癌基因，在三陰性乳腺癌中顯著下調[8]。筆者既往研究表明miR-145表達水平在乳腺癌中顯著下調，患者化療后miR-145表達水平發生顯著上調，某種程度上也預示著化療對腫瘤的清除較為有效，因此筆者推測miR-145有可能可以預示腫瘤的治療效果。同樣，既往研究發現乳腺癌中miR-210表達水平顯著上調[9]，而本研究提示患者化療之后miR-210表達呈現下調的趨勢，這也表明miR-210也可能成為化療效果評價的一個預測因子。

miR-145定位于染色體5q32-33，通過靶向N-ras基因調控血管內皮生長因子（AVEGF-A）的表達來抑制乳腺癌組織血管生成，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[10]。作為抑癌基因，miR-145在三陰性乳腺癌中明顯下調[9]。Hong等[11]研究發現抑制miR-145的生物合成，能夠促進c-myc的表達，而后者通過抑制p38 MAPK從而促進乳腺癌細胞和野生型小鼠胚胎成纖維細胞株MEFs細胞的增殖。Kim等[12]運用腺病毒載體過表達miR-145與5-Fu聯合治療原位乳腺癌的小鼠可以顯著提高5-Fu的抗腫瘤效果。

圖1 各miRNA定量PCR的熔解曲線和擴增曲線（A：miR-125熔解曲線；B：miR-125擴增曲線；C：miR-145熔解曲線；D：miR-145擴增曲線；E：miR-155熔解曲線；F：miR-155擴增曲線；G：miR-203熔解曲線；H：miR-203擴增曲線；I：miR-210熔解曲線；J：miR-210擴增曲線；K：miR-let-7a熔解曲線；L：miR-let-7a擴增曲線；M：U6熔解曲線；N：U6擴增曲線）

miR-210是一個原癌基因，有研究證實，在很多實體腫瘤包括乳腺癌中miR-210普遍呈高表達，并且與乳腺癌的不良預后有關[13]。腫瘤干細胞的存在是腫瘤逃避化療藥物，發生侵襲、轉移的重要原因，低氧微環境有利于腫瘤干細胞的生長，低氧微環境能夠誘導產生缺氧誘導因子（HIF），29%的原發性乳腺癌中HIF-1α高表達，而轉移瘤中69%的HIF-1α高表達。在低氧環境下HIF-1α能夠介導miR-210表達上調[14-17]，導致腫瘤發生[18]。一方面，miR-210能促進腫瘤體內毛細血管生成，提高腫瘤轉移能力；另一方面，miR-210能夠靶向抑制琥珀酸脫氫酶亞單位SDHD，從而抑制了三羧酸循環這一有氧代謝途徑，從而導致細胞的無氧代謝途徑更加活躍，進一步激活HIF-1，形成一個正反饋環路不斷激活該途徑[15]。miR-210還能直接抑制c-myc的拮抗劑Max結合蛋白（MNT）的表達以促進基因轉錄并加速細胞周期[19]，以及通過抑制靶向半胱氨酸蛋白酶8相關蛋白2（CASP8AP2）表達從而抑制缺氧適應的腫瘤干細胞凋亡。

新輔助化療是局部晚期乳腺癌的標準化治療，但目前臨床對療效的評估尚缺乏精確而科學的方法。本研究發現FEC方案新輔助化療后乳腺癌組織中miR-145的表達水平顯著升高而miR-210的表達水平顯著下降，提示可能與乳腺癌化療效果相關。筆者推測，化療前后乳腺癌組織中miR-145和miR-210的變化可能可以用于化療療效預測，但本研究樣本量偏少，有待擴大樣本以及依據乳腺癌的不同分子分型進行進一步研究。

[1] Nigenda G,Caballero M,Gonzá lez-Robledo L M.Access barriers in early diagnosis of breast cancer in the Federal District and Oaxaca[J].Salud Publica Mex,2009,51(Supp l2):s254-s262.

[2] 李輝章,毛偉敏,汪祥輝,等.浙江省腫瘤登記地區2010年癌癥發病與死亡分析[J].中國腫瘤,2014,23(7):531-537.

[3] Le M T,Teh C,Shyh-Chang N,et al.MicroRNA-125b is a novel negative regulator of p53[J].Genes Dev,2009,23(7):862-876.

[4] Hua S,Xiaotao X,Renhua G,et al.Reduced miR-31 and let-7 maintain the balance between differentiation and quiescence in lung cancer stem-like side population cells[J].Biomed Pharmacother,2012,66(2):89-97.

[5] Iyer A,Zurolo E,Prabowo A,et al.MicroRNA-146a:a key regulator of astrocyte-mediated inflammatory response[J].PLoS One, 2012,7(9):e44789.

[6] Esquela-Kerscher A,Slack F J.OncomiRs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[7] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[8] Iorio M V,Ferracin M,Liu C G,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer Res,2005,65(16): 7065-7070.

[9] Farazi T A,Horlings H M,Ten Hoeve J J,et al.MicroRNA sequence and expression analysis in breast tumors by deep sequencing[J].Cancer Res,2011,71(13):4443-4453.

[10] Zou C,Xu Q,Mao F,et al.MiR-145 inhibits tumor angiogenesis and growth by N-RAS and VEGF[J].Cell Cycle,2012,11(11): 2137-2145.

[11] Hong S,Noh H,Chen H,et al.Signaling by p38 MAPK stimulates nuclear localization of the microp rocessor component p68 for processing of selected primary microRNAs[J].Sci Signal,2013,6 (266):ra16.

[12] Kim S J,Oh J S,Shin J Y,et al.Development of microRNA-145 for therapeutic application in breast cancer[J].J Control Release,2011,155(3):427-434.

[13] Toyama T,Kondo N,Endo Y,et al.High expression of microRNA-210 is an independent factor indicating a poor prognosis in Japanese triple-negative breast cancer patients[J].Jpn J Clin Oncol,2012,42(4):256-263.

[14] Kosaka N,IguchiH,Yoshioka Y,et al.Competitive interactions of cancer cells and normal cells via secretory microRNAs[J].J Biol Chem,2012,287(2):1397-1405.

[15] Puisségur M P,Mazure N M,Bertero T,et al.MiR-210 is overexpressed in late stages of lung cancer and mediates mitochondrialalterations associated with modulation of HIF-1 activity[J].Cell Death Differ,2011,18(3):465-478.

[16] Camps C,Buffa F M,Colella S,et al.Hsa-miR-210 is induced by hypoxia and is an independent prognostic factor in breast cancer[J].Clin Cancer Res,2008,14(5):1340-1348.

[17] Camps C,Saini H K,Mole D R,et al.Integrated analysis of microRNA and mRNA expression and association with HIF binding reveals the complexity of microRNA expression regulation under hypoxia[J].Mol Cancer,2014,13:28.

[18] Huang X,Ding L,Benne with K L,et al.Hypoxia-inducible miR-210 regulates normoxic gene expression involved in tumor initiation[J].Mol Cell,2009,35(6):856-867.

[19] Zhang Z,Sun H,DaiH,et al.MicroRNAmiR-210modulates cellular response to hypoxia through the MYC antagonist MNT[J]. Cell Cycle,2009,8(17):2756-2768.

Differential expression of miRNA in breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy

XIE Xiaohong,GU Xidong,ZHAO Hong,et al.Department of Breast Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006, China

Breastcancer Neoad juvant chemotherapy miRNA miR-145 miR-210

2015-06-16）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學基金（LY12H 16008）

310006杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院乳腺科

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miRNA in breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy. Methods Tissue samples were collected from 15 patients with breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy of FEC regime,and the expressions of miR-125,miR-145,miR-155,miR-210,miR-203 and miR-let-7 were detected with quantitative PCR analysis. Results There were no significant differences in expressions of miR-125,miR-155, miR-203 and miR-let-7 before and after chemotherapy,while the expression of miR-145 was increased and the expression of miR-210 was decreased(both P＜0.05). Conclusion The expressions of miR-145 and miR-210 were significantly changed in breast cancer after chemotherapy with FEC scheme.