纖溶系統對羅格列酮治療肺纖維化的影響及信號機制

張彥萍，白林林，李 娜，馬麗華，崔麗亞

(1.河北醫科大學第二醫院呼吸內二科，河北 石家莊 050000； 2.河北省邢臺市人民醫院呼吸科，河北 邢臺 054000)

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·論 著·

纖溶系統對羅格列酮治療肺纖維化的影響及信號機制

張彥萍1，白林林2，李 娜1，馬麗華1，崔麗亞1

(1.河北醫科大學第二醫院呼吸內二科，河北 石家莊 050000； 2.河北省邢臺市人民醫院呼吸科，河北 邢臺 054000)

目的探討纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)對羅格列酮抑制成纖維細胞轉化的影響及信號機制。方法大鼠胚肺成纖維細胞隨機分為3組：羅格列酮組、PAI-1組、對照組。羅格列酮組加入羅格列酮30 mmol/L，PAI-1組加入羅格列酮30 mmol/L及PAI-1 20 mmol/L，對照組加入培養基。分別于24 、48 、72 h收取細胞凍存。采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測成纖維細胞24 h PAI-1和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)mRNA的表達；Western Blot方法分析3個時間點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的蛋白表達。結果羅格列酮抑制成纖維細胞PAI-1 mRNA、α-SMA mRNA及ERK的蛋白表達，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；上調成纖維細胞內PAI-1表達后，羅格列酮對PAI-1、α-SMA 的基因表達及3個時間點ERK蛋白表達的抑制作用均減弱，與羅格列酮組比較差異有統計學意義(P<0.05)；羅格列酮對AKT蛋白表達無抑制作用(P>0.05)。結論羅格列酮通過抑制大鼠成纖維細胞PAI-1的表達活化纖溶系統；上調PAI-1表達可以使羅格列酮抑制成纖維細胞轉化的能力減弱，這種作用可能是通過PAI-1與ERK信號途徑之間的相互作用實現的。

肺纖維化；羅格列酮；纖溶酶原激活物抑制物1

肺間質纖維化的發病率逐年增加，已成為臨床亟待解決的課題。以往研究認為，微環境變化、上皮細胞損傷、細胞因子釋放、成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞等可能參與了肺纖維化的發病[1]。近年研究表明，纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)可能是一個獨立的促纖維化因子，降低PAI-1表達可以減輕博萊霉素誘導的肺纖維化[2]。在治療方面，雖然激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物已在臨床應用，但肺纖維化還沒有規范的治療方法。有報道顯示羅格列酮除了調節脂肪代謝、糖代謝、動脈硬化外，還具有強烈的抗器官纖維化作用[3]，但機制尚不清楚。本研究探討PAI-1是否參與了羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的過程，以及改變纖溶系統的活性對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號途徑的影響，旨在從羅格列酮治療肺纖維化的角度說明纖溶系統在肺纖維化發病中的作用。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑 大鼠胚肺成纖維細胞(本室凍存)；胎牛血清、DMEM-F12培養基(Gibco公司)；PAI-1蛋白(美國 PEPROTECH公司)；PAI-1、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)引物(上海生工生物工程有限公司)；兔抗大鼠ERK、AKT多克隆抗體(美國Bioworld公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記山羊抗兔IgG二抗(中山金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇 取出呼吸病研究室凍存的大鼠胚肺成纖維細胞，迅速置于37 ℃水浴中復蘇。將細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM-F12培養基中，于5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養。傳至第三代時進行藥物干預。將細胞分為3組：羅格列酮組、PAI-1組、對照組。羅格列酮組加入羅格列酮(30 mmol/L)，PAI-1組加入羅格列酮30 mmol/L及PAI-1 20 mmol/L，對照組加入培養基。分別于24、48、72 h收取細胞凍存。

1.2.2 RT-PCR法測定24 h PAI-1、α-SMA mRNA含量 采用Trizol法提取總RNA，按照TaKaRa公司試劑盒說明書反轉錄成CDNA，保存于-20 ℃中備用。PAI-1上游引物：5′-CCTTCCAGAGTCCC-ATACA-3′；下游引物：5′-CTGG CTCTTTCCACC-TCT-3′。α-SMA上游引物：5′- CCTTCCAGAG TCCCATACA-3′；下游引物：5′-CTGGCTCTTTC-CACCTCT-3′。內參照GAPDH上游引物：5′-CCATGTTTGTGATGGGTGTGAACCA-3′；下游引物:5′- ACCAGTGGATGCAGGATGATGTTC-3′。

1.2.3 Westen-Blot測定24、48、72 h AKT、ERK的蛋白表達 用RIPA細胞裂解液將細胞充分裂解，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，加溴酚藍沸水中煮沸5 min變性，按照SDS-聚丙烯酰胺二凝膠電泳操作說明書經過電泳，轉膜，封閉，加入相應一抗(AKT、ERK一抗以1∶500稀釋，β-actin一抗以1∶2 000稀釋)，洗膜，HRP標記的特異性二抗以1∶2 000稀釋，增強化學發光法顯色后，圖像采集，軟件分析得出數據。

2 結 果

2.1 大鼠胚肺成纖維細胞PAI-1和α-SMA mRA的基因表達 羅格列酮組成纖維細胞內加入羅格列酮24 h后，PAI-1 mRNA和α-SMA mRNA的表達下調，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。PAI-I組成纖維細胞內加入羅格列酮后，再加入外源性PAI-1，PAI-1 mRNA和α-SMA mRA的表達再次上調，與羅格列酮組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，2和表1。

圖1 羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細胞PAI-1 mRNA的表達C：對照組；R：羅格列酮組；P：PAI-1組

Figure 1 Rosiglitazone inhibited PAI-1 mRNA expressions of fibroblasts from rats′ embryo lung tissues

圖2 上調PAI-1表達對羅格列酮抑制成纖維細胞α-SMA mRNA表達的影響C：對照組；R：羅格列酮組；P：PAI-1組

Figure 2 The effect of up-regulation PAI-1 expression in rosiglitazone inhibition on α-SMA mRNA expression of fibroblasts

表1 各組成纖維細胞PAI-1 mRNA和α-SMA mRNA表達比較

Table 1 The expression of PAI-1 mRNA and α-SMA mRNAin fibroblasts among three groups

組別PAI-1mRNAα-SMAmRNA對照組 0.921±0.0381.087±0.048羅格列酮組0.379±0.024*0.944±0.028*PAI-1組 0.900±0.006#1.225±0.027#F 84.30585.580P 0.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與羅格列酮組比較(q檢驗)

2.2 上調PAI-1表達對成纖維細胞AKT及ERK蛋白表達的影響 Western Blot結果顯示羅格列酮作用后對AKT蛋白表達沒有影響(P>0.05)；羅格列酮使ERK蛋白表達下調，3個時間點與對照組比較差異有統計學意義；上調PAI-1表達后，羅格列酮對ERK蛋白的抑制作用均減弱，3個時間點PAI-1組與羅格列酮組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3和表2。

圖3 上調PAI-1表達對羅格列酮抑制成纖維細胞AKT及ERK蛋白表達的影響C:對照組;R:羅格列酮組;P:PAI-1組

Figure 3 The effect of up-regulation PAI-1 expression in rosiglitazone inhibition on AKT and ERK protein expressions of fibroblasts

表2 不同時間點成纖維細胞內AKT和ERK表達比較

Table 2 The protein expression of AKT and ERK in fibroblasts at different time

組別AKT/β-actinERK/β-actin對照組0.519±0.0303.007±0.211羅格列酮組24h0.562±0.0111.048±0.030*PAI-1組24h0.503±0.0331.616±0.020#羅格列酮48h0.534±0.0322.114±0.041*PAI-1組48h0.523±0.0142.623±0.094#羅格列酮組72h0.485±0.0351.790±0.091*PAI-1組72h0.546±0.0442.616±0.035# F2.736153.548 P0.0570.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與羅格列酮組比較(q檢驗)

3 討 論

特發性肺纖維化發病機制尚不清楚。以往研究表明，吸煙、病毒感染、肺泡上皮反復發生微小損傷后的異常修復、成纖維細胞轉化為高表達α-SMA的肌成纖維細胞、上皮細胞-間質細胞轉化等因素與發病有關[4]。研究表明，纖溶系統不但在凝血及纖溶過程中發揮重要作用，而且在細胞增殖、凋亡、腫瘤細胞遷移，尤其在器官纖維化中亦發揮著重要作用[5]。近年來對于PAI-1的研究已經有了長足的進展。我們前期研究表明，成纖維細胞內轉染PAI-1 siRNA，可以抑制其增殖、促進其凋亡[6]，氣管內滴入PAI-1 siRNA可減輕博萊霉素誘導的肺纖維化[2]。PAI-1可能作為一個獨立的促纖維化因子，促進肺纖維化的發生發展。

激素及免疫抑制劑對IPF患者的療效較差，已經不推薦使用。雖然吡非尼酮已經用于臨床[7]，但價格昂貴，療效有待進一步觀察。近年研究表明，羅格列酮作為研究最多的外源性過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)激動劑，具有調節脂肪及糖代謝、細胞增殖及凋亡、炎癥及纖維化的作用[3]。尤其在肝、腎、角膜、肺纖維化等的治療過程中，可以是PPARγ依賴和非依賴性的[8-9]。本研究從基因水平證實羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細胞α-SMA的表達，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，阻滯肺纖維化的發生發展。這與以往研究觀察到羅格列酮抑制轉化生長因子β誘導的人成纖維細胞轉化，減輕博萊霉素誘導的肺纖維化并降低大鼠死亡率等結果相一致[10]。本研究探討在羅格列酮治療肺纖維化過程中是否有纖溶系統參與以及PAI-1與AKT、ERK信號途徑的關系，從治療角度說明纖溶系統在肺纖維化發病中的作用。

關于羅格列酮抑制肺纖維化的分子學機制，以往研究表明，PPARγ活化可以調節炎癥到損傷愈合的轉換及上皮細胞-間質細胞轉化[3]；通過減低轉化生長因子β水平減輕博萊霉素誘導肺纖維化[10]；通過抑制 JAK/STAT和ERK信號途徑減輕IL-13誘導的氣道成纖維細胞膠原沉積[11]。本研究觀察到，羅格列酮可以抑制成纖維細胞PAI-1表達，使纖溶活性升高，同時羅格列酮持續抑制ERK蛋白的活性；上調PAI-1表達后，羅格列酮抑制成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的能力減弱，同時對ERK表達的抑制作用也減弱。因此，我們認為纖溶系統的參與可能是羅格列酮治療肺纖維化的新機制，也進一步說明PAI-1在肺纖維化發病中起重要作用。

近期國外已有研究表明羅格列酮通過改變纖溶活性抑制心肌、腎纖維化及腫瘤活性。如Meng等[12]觀察到PPARγ與Smad信號蛋白的相互作用抑制血管緊張素2誘導的PAI-1產生，進而抑制心肌成纖維細胞增殖。Carter等[13]觀察到PPARγ激動劑降低PAI-1表達，抑制乳腺癌細胞轉移，這個過程可能是通過改變纖溶系統的活性實現的。羅格列酮通過改變纖溶活性抑制成纖維細胞增殖及轉化的報道尚未檢索到。本研究結果表明PAI-1與ERK信號途徑的相互作用可能是羅格列酮治療肺纖維化的關鍵環節，PAI-1是肺纖維化發病的獨立危險因素，降低PAI-1活性可能對肺纖維化治療有益。

綜上所述，羅格列酮抑制成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，與以往研究機制不同。我們認為，PAI-1與ERK信號途徑之間的相互作用可能參與了這一過程，纖溶系統在羅格列酮治療肺纖維化過程中發揮了重要作用。

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(本文編輯：許卓文)

Rosiglitazone in treatment of lung fibrosis through activation fibrinolysis system and ERK signal pathway

ZHANG Yan-ping1,BAI Lin-lin2，LI Na1,MA Li-hua1，CUI Li-ya1

(1.Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China；2.Department of Respiratory Medicine,the People′sHospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai 054000,China)

Objective To investigate the effect of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) in rosiglitazone inhibition the transformation of fibroblasts and the signal mechanism in the process.Methods The fibroblasts from rats' embryo lung tissues were divided into three groups: rosiglitazone,PAI-1 and control groups.The fibroblasts in rosiglitazone group were added with 30 mmol/L rosiglitazone,the fibroblasts in PAI-1 group were added with 30 mmol/L rosiglitazone and 20 mmol/L extrinsic PAI-1,and the amount of culture medium was added in the control group.The fibroblasts were collected at 24 h,48 h and 72 h,and were storaged at frozen condition.The mRNA expression of PAI-1 and α-SMA at 24 h were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Western Blot analysis was used to determine the expression of serine/threonine kinase(AKT) and extracellular regulated protein kinases(ERK) at 24 h,48 h and 72 h.Results Rosiglitazone inhibited PAI-1 mRNA,α-SMA mRNA and ERK protein expression of fibroblasts,and there were significant difference in rosiglitazone group compared with control group(P<0.05).The inhibition effect was alleviated by up-regulation PAI-1 expression of fibroblasts,there was significant difference in PAI-1 group compared with rosiglitazone group(P<0.05).The expression of AKT showed no difference among three groups(P>0.05).Conclusion Rosiglitazone inhibits the transformation of lung fibroblasts through inhibition on the expression of PAI-1 that activates fibrinolytic system and through the cross-talk between PAI-1 and ERK signal pathway.

pulmonary fibrosis；rosiglitazone；plasminogen activator inhibitor 1

2015-05-28；

2015-08-04

河北省自然科學基金(C2009001161)

張彥萍(1968-)，女，河北吳橋人，河北醫科大學第二醫院主任醫師，教授，醫學博士，從事肺間質纖維化疾病診治研究。

R563.13

A

1007-3205(2015)11-1241-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.001