肺腺癌轉移機制的研究與探討

宋 曉，席 強，王 剛

(1.河北北方學院附屬第一醫院放療科，河北 張家口 075000；2.四川大學國家生物醫學材料工程技術研究中心，四川 成都 610064)

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·論 著·

肺腺癌轉移機制的研究與探討

宋 曉1，席 強1，王 剛2

(1.河北北方學院附屬第一醫院放療科，河北 張家口 075000；2.四川大學國家生物醫學材料工程技術研究中心，四川 成都 610064)

目的篩選轉移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜。方法利用現代高通量表達譜芯片技術比較4對轉移性肺腺癌組織與其相應正常組織之間的差異基因表達圖譜。通過文獻挖掘和生物信息學方法分析顯著性差異表達基因的功能。結果與正常組織比較，在轉移性肺腺癌組織中發現了46個顯著性差異表達基因，其中包括24個高表達的差異基因(USP33、FOXC1和PPBP等)和22個低表達的差異基因(SPATA13、SBF1和TFIP11等)。生物信息學分析表明，這些基因在腫瘤的發生和轉移過程中發揮著重要的作用。結論基因表達圖譜的改變與腫瘤的發生和轉移密切相關。

肺腫瘤；腫瘤轉移;基因表達譜doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.026

21世紀，肺癌在世界范圍內是癌癥相關死亡的主要原因之一，5年生存率僅為5%～8%[1-2]。轉移是癌癥最主要的惡性標志和特征之一，也是導致癌癥治療失敗和癌癥患者死亡的最主要原因，80%～90%肺癌患者死亡是由轉移引起的[3-5]。轉移形成最關鍵的異常通路包括酪氨酸激酶受體、上皮-間質細胞轉型、腫瘤血管形成等[6]。但是，對于腫瘤細胞轉移過程中的很多機制還知之甚少。本研究利用全基因組表達譜芯片技術，篩選轉移性肺腺癌患者的癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜，旨在為腫瘤轉移的臨床診斷和治療提供理論依據和支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1—12月河北北方學院附屬第一醫院轉移性肺腺癌患者4例的癌組織樣本和相應正常組織樣本。所有患者的組織樣本都經過病理科2位資深病理專家的診斷，保證組織樣本病理資料的可靠性與取材樣本的準確性。在樣本取材之前，患者以及家屬均簽署知情同意書，并經過醫院醫學倫理委員會的同意。臨床患者信息見表1。

表1 患者臨床信息

1.2RNA抽提和純化 采用RNeasyMiniKit(QIAGEN)并且根據生產廠商提供的標準操作流程進行樣品的總RNA抽提，抽提所得總RNA經安捷倫2100生物分析儀電泳質檢合格后備用。

1.3 樣品RNA的放大和標記 樣本RNA采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒，單色標記試劑盒和標準操作流程對樣品總RNA中的mRNA進行放大和標記，并用RNeasyMiniTit(QIAGEN)純化標記后的cRNA。

1.4 芯片雜交 按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中65 ℃，10r/min，滾動雜交17h，雜交cRNA上樣量1.65μg，并在洗缸(ThermoFisher)中洗片，洗片所用的試劑為基因表達譜芯片洗脫緩沖液試劑盒。

1.5 芯片掃描 完成雜交的芯片采用安捷倫芯片掃描儀進行掃描，用FeatureExtractionSoftware10.7讀取數據，最后采用GeneSpringSoftware11.0進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.6 差異基因篩選 用基因芯片顯著性分析(SignificantAnalysisofMicroarray，SAM)方法篩選具有差異表達的基因。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 基因本體論(geneontology,GO)分析 通過TheGeneOntology數據庫，GO分析可以分析差異表達基因的主要功能。Fisher檢驗和χ2檢驗來區分和選擇顯著性的GO亞類，GO校驗計算返回的富集度P值表明GO功能是否具有顯著性。

1.7.2Pathway(通路)分析 利用KEGG、Biocarta等數據庫，通路分析可以發現差異表達基因的顯著性通路。Fisher檢驗和χ2檢驗用來選擇顯著性的通路，P值和誤判率(falsediscoveryrate，FDR)值用來定義顯著性的閾值。

1.8 統計學方法 應用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析,計數資料比較采用Fisher檢驗和χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜 為了研究轉移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜，篩選出肺腺癌轉移相關基因，了解肺腺癌轉移的相關機制，本研究利用Agilent人類基因表達譜芯片(AgilentWholeHumanGenomeOligoMicroarray，4*44K)區分了轉移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的全基因組表達圖譜。嚴格按照Agilent表達譜芯片的質控標準，以基因表達量改變倍數>2和P<0.05為篩選標準，選出的差異mRNA作為候選基因。在二維基因聚類圖譜中，每一列代表了樣本，每一行代表了探針ID(基因)，顏色的深淺代表了每一個基因在不同樣本中的相對表達量。同時，從聚類圖譜中可以發現樣本的分組情況比較好(圖1)。

2.2 46個候選的差異基因的表達情況 按照上述嚴格的數據處理和篩選標準，與正常組織相比，在轉移性肺腺癌組織中，共發現了46個顯著性的差異表達基因，其中24個差異基因是高表達的，22個差異基因是低表達的。在24個上調的差異表達基因中，泛素特異性肽酶33(ubiquitinspecificpeptidase33，USP33)是上調倍數最多的基因(基因表達變化倍數=13.48，P=0.000 01)。在22個下調的差異表達基因中，釉叢蛋白星湖作用蛋白11(tuftelininteractingprotein11，TFIP11)是下調倍數最多的基因(基因表達變化倍數=7.93，P=0.000 18)。見表2。

表2 46個候選差異基因的表達情況

表2 (續)

2.3 文獻挖掘 通過文獻挖掘，發現在上述46個顯著性差異表達基因中，一些基因已經被報道和研究過與腫瘤的轉移和發生有關，特別是叉頭框蛋白C1(forkheadboxC1,FOXC1)、小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FBJmurineosteosarcomaviraloncogenehomolog，FOS)、視神經萎縮基因1(opticatrophy1，OPA1)、zincfingerandBTBdomaincontaining7A(ZBTB7A)、Thetuberoussclerosis-1(TSC1)這幾個基因，它們的表達與功能在很多腫瘤的轉移和發生過程中發揮著重要的作用。

2.4 生物信息學分析 為了更好地理解和發現這些顯著性差異表達基因在腫瘤的發生和轉移過程中的作用，本研究利用生物信息學方法對這些基因進行了GO和Pathway的深入分析。利用TheGeneOntology數據庫，發現這些顯著性差異表達基因主要影響了16條GO功能(圖2)，其中影響最顯著的GO為細胞凋亡，還有轉座酶活性等。利用KEGG等數據庫進行通路分析，發現了20條顯著性通路(圖3)，其中最顯著的信號通路是IL-6信號通路(IL-6signalingpathway)，還有NK細胞介導細胞毒性的Ras信號通路(Ras-IndependentpathwayinNKcell-mediatedcytotoxicity)等。

3 討 論

本研究利用現代高通量人類表達譜芯片技術[7-8]，比較了轉移性肺腺癌患者的癌組織與相應正常組織之間的全基因組表達圖譜。按照表達譜芯片的嚴格質控標準，以差異倍數>2和P<0.05為篩選標準，在轉移性肺腺癌與相應正常組織之間共篩選出了46個顯著性的差異表達基因。與正常組織相比，在轉移性肺腺癌組織中有24個差異基因是上調表達的，22個差異基因是下調表達的。在24個上調的顯著性差異表達基因中，USP33是上調倍數最多的基因；而在22個下調基因中，TFIP11是下調倍數最多的基因。這些顯著性差異表達基因可能在肺腺癌的發生和轉移過程中發揮著重要的作用。

通過文獻挖掘分析，發現上述46個顯著性差異表達基因，其中一些基因已經被發現和研究過與腫瘤的發生和轉移密切相關。研究發現USP33的表達水平是Slit信號抑制結腸癌細胞遷移的一個重要因素[9]。叉頭框蛋白1(forkheadboxC1，FOXC1)也是上調倍數比較明顯的基因，已有相當多的文獻報道它與癌癥的發生和轉移相關。FOXC1的高表達發生在胰腺導管癌、非小細胞癌、肝癌、乳腺癌等，它的表達與這些腫瘤的發生和預后密切相關[10-12]。同時，FOXC1的高表達可以通過誘導上皮間充質轉換發生和上調神經前體細胞表達、發育調控蛋白9基因(neuralprecursorcellexpressed,developmentallydown-regulated9，NEDD9)的表達來促進肝細胞癌的轉移[12-13]。另外，FOXC1也可以通過誘導基質金屬蛋白酶7(matrixmetalloproteinase7，MMP7)的表達來促進乳腺癌的侵襲能力[14],FOXC1的過表達在非小細胞肺癌的轉移和發生中有重要作用，可以作為非小細胞肺癌治療和預后的一個標志物[15]。視神經萎縮蛋白1(opticatrophy1,OPA1)在肺腺癌中是高表達的，可以預示肺腺癌的預后較差；OPA1突變也在很多疾病中發揮著重要作用[16-17]。ZBTB7A(又稱作LRF、ZBTB7或pokemon等)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌中都是過表達的，它的過表達可以增加腫瘤的惡性程度和耐藥性[18-20]。在轉移性腺癌組織中低表達的22個顯著性差異表達基因中，SPATA13(Spermatogenesis-associatedprotein13，又名Asef2)可以通過調控Rho-familyGTPases的活性來促進癌細胞的遷移和快速粘連運輸[21]，同時Asef2在結腸癌細胞的轉移過程中發揮重要作用[22]。SIRT3在肝細胞癌中是低表達的，作為一個腫瘤抑制因子，它可以通過影響肝癌細胞的增殖和入侵從而發揮重要作用[23]；過表達SIRT3可以抑制乳腺癌細胞的糖酵解過程和細胞增殖過程，為抑制腫瘤的發生提供了一種代謝機制[24]。除了上述描述的基因外，在轉移性腺癌組織中高表達的基因E2F6(E2Ftranscriptionfactor6)、ACRBP(acrosinbindingprotein)、ARL6IP1(ADP-ribosylationfactor-likeprotein6-interactingprotein1)，低表達的基因TSC1、PKNOX1(PBX/knotted1homeobox1)等基因與腫瘤的發生和轉移有關。

為了更加深入地了解這些顯著性差異表達基因在腫瘤的發生和轉移過程中發揮的重要作用，本研究利用生物信息學方法對這些基因進行了GO和Pathway分析。通過TheGeneOntology數據庫分析，發現了16條顯著性GO，其中包括細胞凋亡、轉座酶活性等。通過KEGG數據庫進行Pathway分析，篩選出20條顯著性Pathway，包括IL-6信號通路(IL-6signalingpathway)、自然殺傷細胞介導細胞毒性的Ras信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等。其中一些重要的通路，如Ras通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路在腫瘤的發生和轉移過程中都發揮著重要的作用[25-27]。

本研究結果表明，在肺腺癌的發生和轉移過程中，基因表達圖譜會發生很多變化，尤其是一些與腫瘤發生和轉移密切相關的基因。通過區分轉移性肺腺癌組織與正常組織之間的全基因組表達譜，可以為臨床治療提供參考數據。總之，利用基因表達譜來區分、預測、治療肺腺癌可能會成為未來臨床應用的一個很好的工具。(本文圖見封三)

[1]deSantisCE,LinCC,MariottoAB,etal.Cancertreatmentandsurvivorshipstatistics,2014[J].CACancerJClin，2014,64(4):252-271.

[2]RidgeCA,McErleanAM,GinsbergMS.Epidemiologyoflungcancer[J].SeminInterventRadiol，2013,30(2):93-98.

[3]WanL,PantelK,KangY.Tumormetastasis:movingnewbiologicalinsightsintotheclinic[J].NatMed，2013,19(11):1450-1464.

[4]ChenQ,MassaguéJ.Molecularpathways:VCAM-1asapotentialtherapeutictargetinmetastasis[J].ClinCancerRes，2012,18(20):5520-5525.

[5]WellsA,GrahovacJ,WheelerS,etal.Targetingtumorcellmotilityasastrategyagainstinvasionandmetastasis[J].TrendsPharmacolSci，2013,34(5):283-289.

[6]CreightonCJ,GibbonsDL,KurieJM.Theroleofepithelial-mesenchymaltransitionprogrammingininvasionandmetastasis:aclinicalperspective[J].CancerManagRes，2013,5:187-195.

[7]HouR,YangZ,LiM,etal.Impactofthenext-generationsequencingdatadepthonvariousbiologicalresultinferences[J].SciChinaLifeSci,2013,56(2):104-109.

[8]GorretaF,CarboneW,BarzaghiD.Genomicprofiling:cDNAarraysandoligoarrays[J].MethodsMolBiol，2012,823:89-105.

[9]HuangZ,WenP,KongR,etal.USP33mediatesSlit-Robosignalingininhibitingcolorectalcancercellmigration[J].IntJCancer，2015,136(8):1792-1802.

[10]WangL,GuF,LiuCY,etal.HighlevelofFOXC1expressionisassociatedwithpoorprognosisinpancreaticductaladenocarcinoma[J].TumourBiol，2013,34(2):853-858.

[11]WeiLX,ZhouRS,XuHF,etal.HighexpressionofFOXC1isassociatedwithpoorclinicaloutcomeinnon-smallcelllungcancerpatients[J].TumourBiol,2013,34(2):941-946.

[12]XiaL,HuangW,TianD,etal.OverexpressionofforkheadboxC1promotestumormetastasisandindicatespoorprognosisinhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2013,57(2):610-624.

[13]XuZY,DingSM,ZhouL,etal.FOXC1contributestomicrovascularinvasioninprimaryhepatocellularcarcinomaviaregulatingepithelial-mesenchymaltransition[J].IntJBiolSci,2012,8(8):1130-1141.

[14]SizemoreST,KeriRA.TheforkheadboxtranscriptionfactorFOXC1promotesbreastcancerinvasionbyinducingmatrixmetalloprotease7(MMP7)expression[J].JBiolChem,2012,287(29):24631-24640.

[15]WangG,LunardiA,ZhangJ,etal.Zbtb7asuppressesprostatecancerthroughrepressionofaSox9-dependentpathwayforcellularsenescencebypassandtumorinvasion[J].NatGenet，2013,45(7):739-746.

[16]FangHY,ChenCY,ChiouSH,etal.Overexpressionofopticatrophy1proteinincreasescisplatinresistanceviainactivationofcaspase-dependentapoptosisinlungadenocarcinomacells[J].HumPathol,2012,43(1):105-114.

[17]Yu-Wai-ManP,ChinneryPF.Dominantopticatrophy:novelOPA1mutationsandrevisedprevalenceestimates[J].Ophthalmology,2013,120(8):1712.

[18]KimK,ChadalapakaG,LeeSO,etal.IdentificationofoncogenicmicroRNA-17-92/ZBTB4/specificityproteinaxisinbreastcancer[J].Oncogene，2012,31(8):1034-1044.

[19]LunardiA,GuarnerioJ,WangG,etal.RoleofLRF/Pokemoninlineagefatedecisions[J].Blood，2013,121(15):2845-2853.

[20]YangX,ZuX,TangJ,etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercells:implicationsfortheroleofZbtb7incellcycleregulation[J].MolMedRep，2012,5(6):1475-1480.

[21]JeanL,MajumdarD,ShiM,etal.ActivationofRacbyAsef2promotesmyosinⅡ-dependentcontractilitytoinhibitcellmigrationontypeⅠcollagen[J].JCellSci，2013,126(Pt24):5585-5597.

[22]LeveF,Morgado-DíazJA.RhoGTPasesignalinginthedevelopmentofcolorectalcancer[J].JCellBiochem，2012,113(8):2549-2559.

[23]ZhangB,QinL,ZhouCJ,etal.SIRT3expressioninhepatocellularcarcinomaanditsimpactonproliferationandinvasionofhepatomacells[J].AsianPacJTropMed,2013,6(8):649-652.

[24]HaigisMC,DengCX,FinleyLW,etal.SIRT3isamitochondrialtumorsuppressor:ascientifictalethatconnectsaberrantcellularROS,theWarburgeffect,andcarcinogenesis[J].CancerRes,2012,72(10):2468-2472.

[25]WardAF,BraunBS,ShannonKM.TargetingoncogenicRassignalinginhematologicmalignancies[J].Blood，2012,20(17):3397-3406.

[26]SantarpiaL,LippmanSM,El-NaggarAK.TargetingtheMAPK-RAS-RAFsignalingpathwayincancertherapy[J].ExpertOpinTherTargets，2012,16(1):103-119.

[27]YangSH,SharrocksAD,WhitmarshAJ.MAPkinasesignallingcascadesandtranscriptionalregulation[J].Gene，2013,513(1):1-13.

(本文編輯：趙麗潔)

2015-04-01；

2015-06-30

國家自然科學基金資助項目(31370972)

宋曉(1975-)，男，山東乳山人，河北北方學院附屬第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事腫瘤放射治療研究。

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B

1007-3205(2015)11-1332-06