一種繁育Sm22α基因敲除純合子小鼠的方法

高亞坤，林燕玲，段志莉，李曉坤，宋 昱，韓 梅

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

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·技術(shù)方法·

一種繁育Sm22α基因敲除純合子小鼠的方法

高亞坤，林燕玲，段志莉，李曉坤，宋 昱，韓 梅*

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的建立一種繁育平滑肌22alpha(smoothmuscle22alpha，Sm22α)基因敲除純合子(Sm22α-/-)小鼠的方法。方法采用純合子繁育方式即雄性純合子與雌性純合子交配，對(duì)有分娩征兆的孕鼠實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)，剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳。同時(shí)用傳統(tǒng)的雜合子繁育方式即雄性純合子與雌性雜合子交配作為對(duì)照，比較2種繁育方式產(chǎn)生的仔鼠斷乳后存活率，并提取仔鼠尾基因組DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果2種繁育方式受孕率及仔鼠斷乳后成活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；子代純合率基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。結(jié)論純合子繁育方式不僅增加了純合子的數(shù)量，且無(wú)需基因型鑒定，為Sm22α蛋白功能的研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

小鼠,基因敲除；繁殖；純合子doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.035

血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)是血管中膜的主要細(xì)胞成分，其表型轉(zhuǎn)化、增殖與遷移是血管損傷性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。平滑肌22alpha(smoothmuscle22alpha，Sm22α)又稱為轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin)，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為22 000的actin結(jié)合蛋白，具有組織特異性，僅在平滑肌組織中特異性表達(dá)，廣泛用于平滑肌細(xì)胞分化和表型轉(zhuǎn)化的研究。該蛋白除了參與血管平滑肌細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架重構(gòu)外，在血管平滑肌細(xì)胞增殖、血管炎癥及氧化應(yīng)激過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[3-7]。因此，將Sm22α基因敲除(Sm22α-/-)小鼠應(yīng)用于相應(yīng)疾病模型的建立及細(xì)胞分子水平的研究，對(duì)深入理解人類相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)藥物作用的新靶點(diǎn)，具有重要意義。Sm22α蛋白在子宮平滑肌細(xì)胞中，可能通過(guò)表達(dá)量的改變調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而影響子宮平滑肌的收縮，是控制分娩發(fā)動(dòng)的重要蛋白因子[8]。然而，在Sm22α-/-小鼠繁育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有分娩征兆的Sm22α-/-孕鼠常因子宮收縮無(wú)力導(dǎo)致宮內(nèi)窘迫，引起母、胎鼠死亡；而Sm22α+/-雜合子孕鼠產(chǎn)下的幼鼠中，Sm22α-/-純合子鼠所占比例很低，可能與孕期過(guò)程中死亡有關(guān)。為了提高Sm22α-/-小鼠繁育成功率，本研究采用將雄性純合子與雌性純合子(Sm22α-/-♂×Sm22α-/-♀)交配，對(duì)妊娠期滿，有分娩征兆的Sm22α-/-雌鼠行剖腹產(chǎn)手術(shù)，剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳，從而增加了Sm22α-/-純合子小鼠子代的數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sm22α-/-小鼠，購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于溫度濕度恒定的獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)中，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水；ICR小鼠，3～6個(gè)月齡，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。代乳鼠選擇條件：已產(chǎn)過(guò)一胎，仔鼠成活率高，母性較好，有哺乳經(jīng)驗(yàn)的ICR雌鼠。

本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)河北醫(yī)學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器與試劑 恒溫加熱板(Leica公司)；加熱燈；手術(shù)器械(剪刀、鑷子、止血鉗)、紗布，經(jīng)121 ℃高壓滅菌35min；一次性手套、口罩、75%酒精。

1.2.2 Sm22α-/-小鼠交配及ICR代乳鼠制備 隨機(jī)選則6～8周純合子Sm22α-/-雄鼠10只及Sm22α-/-雌鼠20只，每天下午17:00按1∶2合籠、交配，第2天早晨8:00檢查陰道栓；見栓時(shí)認(rèn)為交配成功，并記錄為受孕0.5d，分籠單獨(dú)飼養(yǎng)；妊娠15d后每天認(rèn)真觀察是否有分娩征兆。交配時(shí)間為2周。根據(jù)推斷法，在受孕第19.5d實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)。陰道栓出現(xiàn)假陰性時(shí)，可以根據(jù)觸診觀察法判斷分娩時(shí)間，即孕鼠下腹部膨大，陰道處于開口狀態(tài)，用拇指和食指可以觸摸到胎兒形狀，當(dāng)胎兒的頭和腰部大小近似時(shí)進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù)。ICR代乳雌鼠比Sm22α-/-小鼠提前1～3d與ICR雄鼠進(jìn)行交配。同時(shí)，隨機(jī)選擇6～8周的雜合子Sm22α-/-雄鼠10只及Sm22α+/-雌鼠20只作為普通交配對(duì)照，按1∶2進(jìn)行合籠、交配，持續(xù)2周；所有孕鼠均自然分娩和哺乳。

1.2.3 剖腹產(chǎn)手術(shù) Sm22α-/-孕鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉,75%酒精消毒腹部皮膚，用手術(shù)剪剪開腹部皮膚和肌肉，充分暴露子宮，換一套潔凈手術(shù)器械，立即打開子宮取出仔鼠，用無(wú)菌紗布迅速擦干仔鼠口鼻及身上的羊水、黏液及血跡，將仔鼠置于37℃的電熱恒溫板上，用手指輕拍其胸部輔助呼吸，直至仔鼠全身鮮紅，能自由呼吸為止。剖腹產(chǎn)后Sm22α-/-母鼠，取其子宮組織，用于探究Sm22α影響子宮收縮的機(jī)制。

1.2.4 代乳 將代乳鼠的仔鼠全部棄掉或保留2～4只,取其籠內(nèi)的墊料撒在 Sm22α-/-仔鼠身上，使其染味后放入代乳鼠籠內(nèi)，約隔半小時(shí)后再觀察其是否代乳。記錄Sm22α-/-小鼠仔鼠斷乳后存活情況，計(jì)算斷乳后存活率。

1.2.5 Sm22α-/-小鼠基因型鑒定 提取子代小鼠尾基因組DNA進(jìn)行基因型鑒定，引物序列如下：引物1為5′-GGCCCAGGGGTTGTCAAAATAGTC-3′；引物2為5′-CTCCTCCAGCTCCTCGTCATACTTC-3′；引物3為5′-CGCCGCATAACCAGTGAAACAG-3′。目的基因片段長(zhǎng)度分別為：野生型(Sm22α+/+)480bp；純合型(Sm22α-/-)750bp；雜合型(Sm22α+/-)480bp和750bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 2min，95 ℃ 30s、60 ℃ 45s、72 ℃ 1min(30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5min。取PCR產(chǎn)物10μL用于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種繁育方法受孕率及仔鼠成活率比較 所有小鼠的交配時(shí)間為2周。其中Sm22α-/-小鼠陰道栓檢查陽(yáng)性10只并實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)，共剖得仔鼠65只，全部用ICR小鼠代乳。普通交配方式中，12只雜合型Sm22α+/-小鼠受孕，自然分娩仔鼠70只。2種繁育方法的受孕率及仔鼠斷乳后成活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 2種繁育方法受孕率及仔鼠成活率比較 (只數(shù)，%)

2.2 仔鼠基因型鑒定結(jié)果 用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)對(duì)2種交配方式產(chǎn)生的子代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，純合率分別為100.00%(51/57)和46.77 %(29/62)，與孟德爾遺傳規(guī)律100%和50%的理論值相符。Sm22α+/-雜合型分別在750bp和480bp處可見清晰的PCR條帶，Sm22α-/-純合型在750bp處可見清晰的PCR條帶，見圖1

圖1 仔鼠基因型鑒定結(jié)果

3 討 論

基因敲除小鼠技術(shù)是借助分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物胚胎學(xué)的方法，將小鼠體內(nèi)某種基因的功能缺失，以揭示該基因的功能[9]。Sm22α是血管平滑肌細(xì)胞骨架重構(gòu)的調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)水平的變化與血管平滑肌細(xì)胞的表型重塑和血管疾病密切相關(guān)。近年來(lái)研究者利用Sm22α-/-小鼠建立了多種人類相關(guān)疾病模型[6-7,10]，對(duì)Sm22α在相關(guān)病理過(guò)程及疾病中的作用及機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。因此，建立一種繁育Sm22α-/-小鼠的新方法，增加Sm22α-/-小鼠子代的數(shù)量，有助于進(jìn)一步滿足相關(guān)疾病研究的需要。此外，該方法中，剖腹產(chǎn)后的Sm22α-/-母鼠，可以用于研究Sm22α對(duì)子宮收縮機(jī)制的影響。

基因敲除小鼠通常的繁育方式為雄性純合子與雌性雜合子交配，產(chǎn)生的子代經(jīng)PCR基因鑒定后，純合子小鼠可用于實(shí)驗(yàn)研究。但這種交配方式產(chǎn)生純合子的概率只有50%(實(shí)際的純合子出生率更低)，無(wú)法滿足大量研究需求。而采用純合子交配方式，即雄性純合子×雌性純合子(Sm22α-/-♂×Sm22α-/-♀)交配，剖腹產(chǎn)手術(shù)剖出子代，并由ICR雌鼠代乳，存活的子代全部為純合子，其子代的斷乳后存活率與雜合子交配方式差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺點(diǎn)是需要每天人工交配，檢查陰道栓，并實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)，一定程度上增加了工作量。

在小鼠剖腹產(chǎn)手術(shù)操作過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：①剖腹產(chǎn)手術(shù)確保無(wú)菌操作，所有實(shí)驗(yàn)用手術(shù)器械及紗布均要高壓滅菌，實(shí)驗(yàn)臺(tái)及恒溫加熱板均用75%乙醇消毒；②注意保溫，手術(shù)操作全程在37 ℃左右的環(huán)境下進(jìn)行，剖出的仔鼠置于37 ℃電熱恒溫加熱板上，防止溫度過(guò)低導(dǎo)致其死亡；③手術(shù)操作過(guò)程要迅速，快速處死待剖腹產(chǎn)雌鼠，快速取出子宮，快速剝離胎兒，并迅速將其口鼻及身上黏液等物質(zhì)反復(fù)擦干凈，使其自由呼吸；④染味時(shí)間要足夠，用代乳鼠籠內(nèi)墊料或尿液染味2～3min，防止代乳鼠吃仔鼠現(xiàn)象；⑤不要過(guò)早更換代乳鼠籠內(nèi)墊料，代乳1周后可更換墊料，以免造成環(huán)境改變，引起代乳鼠應(yīng)激反應(yīng)。此外，要準(zhǔn)確計(jì)算小鼠妊娠期，提前進(jìn)行剖宮產(chǎn)，可能部分仔鼠尚未發(fā)育成熟，影響其存活率，推遲行剖腹產(chǎn)，可能造成母鼠宮內(nèi)窘迫，引起母鼠及仔鼠的死亡。

本研究首次選用經(jīng)產(chǎn)的ICR母鼠進(jìn)行代乳，主要是因其性情溫順，幾乎沒有吃仔鼠行為，在小鼠剖腹產(chǎn)代乳研究中較多應(yīng)用[11]。同時(shí)，由于ICR小鼠與Sm22α-/-小鼠的體型、毛色等基本性狀截然不同，所以不會(huì)造成遺傳污染。此外，在代乳過(guò)程中將代乳鼠的仔鼠保留2～4只，是為了繁育ICR小鼠，以滿足代乳需要，而對(duì)Sm22α-/-仔鼠的成活率沒有影響。研究發(fā)現(xiàn)ICR代乳鼠一次代乳6～7只仔鼠時(shí)，仔鼠成活率最高，所以當(dāng)Sm22α-/-產(chǎn)仔較多時(shí)，將ICR仔鼠全部棄掉。棄掉的仔鼠全部人工喂養(yǎng)，避免了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2種交配方式產(chǎn)生的子代小鼠斷乳后存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而純合子交配方式產(chǎn)生的純合子數(shù)量大，無(wú)需進(jìn)行基因型鑒定，能更好地滿足基礎(chǔ)研究的需求。

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(本文編輯：趙麗潔)

2015-09-07；

2015-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(31271222；31471092)

高亞坤(1987-)，女，河北滄州人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事血管生物學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：hanmei@hebmu.edu.cn

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1007-3205(2015)11-1356-03