三聚氰胺致泌尿系結石的動物模型研究進展

石紅霞，楊淑芬，張長榮(綜述),陸　晨※(審校)

三聚氰胺致泌尿系結石的動物模型研究進展

石紅霞1△，楊淑芬2，張長榮2(綜述),陸晨2※(審校)

摘要：2008年9月我國發生三聚氰胺污染嬰幼兒奶粉所致嬰幼兒泌尿系結石事件，致使三聚氰胺的毒理學安全性受到公眾廣泛關注。國內外大量研究發現，長期大劑量攝入三聚氰胺不僅可引起泌尿系結石，還可造成腎功能異常甚至腎衰竭。建立三聚氰胺結石動物模型是研究疾病病因、致病機制及制訂治療方案的有效方法。該文就三聚氰胺致泌尿系結石的動物模型以及三聚氰胺致腎結石動物模型的特點予以綜述。

關鍵詞：三聚氰胺；結石；動物模型

三聚氰胺是德國化學家在1834年首次合成的一種重要的氮雜環有機化工染料，其不僅可用于涂料、塑料、紡織、醫藥等，也可作為阻燃劑、減水劑和甲醛清潔劑，還可合成藥物的中間體或藥物載體原料等；三聚氰胺俗稱蛋白精，其含氮量很高(66%)，在凱氏定氮法中可表現出高蛋白質水平的假象，并且生產工藝簡單、成本低廉[1-2]。因此就有不法商家通過在人類食品、寵物食品、家畜飼料中添加三聚氰胺，以提升含氮量，替代蛋白質(如2007年的寵物飼料事件與2008年的三鹿奶粉事件)[3-4]。2008年我國近30萬食用添加有三聚氰胺的三鹿奶粉的嬰幼兒發生泌尿系結石、腎衰竭甚至死亡[4]。鑒于該事件對我國食品安全產生的影響，因此有必要設計和建立與人類三聚氰胺導致尿石癥相類似的動物模型，為探討三聚氰胺致泌尿系結石的形成機制、指導臨床治療及篩選抗結石的藥物、預防和延緩結石形成等方面提供科學依據。

1三聚氰胺致結石的動物實驗模型探討

三聚氰胺是一種具有輕微毒性的化工原料；國際化學品安全卡提到，長期或反復大量攝入含三聚氰胺的食品，可能對腎與膀胱產生危害，最終會導致泌尿系統結石的形成[5]。大量的研究也發現，連續大劑量使用三聚氰胺可導致泌尿系結石的發生[6-8]。三聚氰胺引起的泌尿系結石按形成部位分為腎結石、膀胱結石、輸尿管結石，但有時攝入三聚氰胺形成的結石也可同時在兩個部位出現[5-8]。

1.1三聚氰胺致腎結石的動物模型在工業生產過程中，三聚氰胺可逐步水解生成三聚氰酸，因而三聚氰胺原料中常常摻雜有少量的三聚氰酸。三聚氰胺本身為低毒性，一般情況下進入成年人體內的三聚氰胺大部分可自行排出；但如果該物質在腎內與其類似物三聚氰酸結合則會形成難以溶解的氰尿酸三聚氰胺化合物，并在此基礎上形成結石而堵塞腎小管，導致腎功能損害[9]。楊海東等[7]探討三聚氰胺及其類似物(三聚氰酸)致腎結石動物模型的建立，將大鼠分為對照組和實驗組，并根據每只大鼠每日進食三聚氰胺和三聚氰酸量的不同,將實驗組分為3組，對照組每日給予羧甲基纖維素鈉灌胃；實驗觀察到，對照組大鼠腎皮質及髓質無結晶形成；實驗組給予不同劑量三聚氰胺及其類似物后，各組大鼠腎臟病理切片均有結晶形成,但其中一組采用三聚氰胺及三聚氰酸灌胃的量為每日121 mg/kg連續灌胃1周,能成功建立三聚氰胺及其類似物(三聚氰酸)腎結石動物模型且動物病死率低、易操作，結石形成周期短、重復性好；該研究說明，三聚氰胺及其類似物(三聚氰酸)可引起動物腎結石。梁毅文等[8]對三聚氰胺及三聚氰酸導致腎臟損害的機制進行研究也發現，兩者聯合對大鼠進行灌胃會在腎臟形成一種晶體，堵塞腎小管，造成腎臟損害甚至急性腎衰竭；而且實驗還發現，兩者同時混合注入導致大鼠出現低pH值尿、高尿酸血癥，這些因素會增加尿結石的發生率并進一步誘發結石。2007年Puschner等[10]和2008年Dobson等[11]的動物研究也都證明了三聚氰胺和三聚氰酸聯合攝入會導致大量晶體堵塞腎小管，最終導致腎結石形成。2008年，有學者對貓、犬、豬和魚等動物進行三聚氰胺毒性實驗，同時給予三聚氰胺和三聚氰酸，發現動物腎臟出現含有三聚氰胺和三聚氰酸的復合晶體，提示腎結石形成，繼而出現腎衰竭[12-14]。2011年，吳德生等[15]對三聚氰胺聯合三聚氰酸經口28 d染毒對大鼠腎臟進行觀察，發現腎臟出現結晶現象，提示有腎結石產生。Baynes等[16]對5只豬單獨使用三聚氰胺的實驗結果表明，三聚氰胺本身能輕易從腎臟排泄。有些學者的研究證實，單獨使用三聚氰胺或三聚氰酸不會對腎臟產生毒性作用，同時還發現兩者在一定濃度內不會影響腎臟功能；但混合攝入則會使機體產生大量的難溶性晶體，沉積在腎小管，使大鼠發生急性腎衰竭而導致死亡[10-11]。以上研究表明，三聚氰胺或三聚氰酸單獨使用對腎臟沒有毒性，但混合使用不僅可以形成腎結石還可導致腎臟的損傷甚至腎衰竭及死亡。長期高濃度攝入三聚氰胺或三聚氰酸可致腎結石、腎臟損害等，在既往國外的動物實驗及國內的研究中都得到了證實[17-18]。

1.2三聚氰胺致膀胱結石的動物模型鄒移海等[19]通過動物實驗表明，用工業原料三聚氰胺連續給藥可誘發SD大鼠形成膀胱結石；研究還觀察到，在給藥第20日、第30日時，各組大鼠的腎臟未見結石和沉淀形成,但有部分大鼠膀胱黏膜充血,并出現膀胱結石；其中給藥第20日、第30日各組有50%以上大鼠出現淡黃色與白色混合或白色的膀胱結石；實驗說明低劑量，即0.05～0.4 g/kg三聚氰胺連續給藥30 d,可誘發大鼠產生膀胱結石。此后，鄒移海等[20]繼續研究發現，以0.5～2.5 g/kg劑量的三聚氰胺給大鼠灌胃20 d，僅有部分大鼠出現膀胱結石。由于工業原料三聚氰胺含雜質較多，不但不利于分析結石成分，也不利于三聚氰胺動物模型的規范化造模。陳嘉等[21]為了探討三聚氰胺形成泌尿系結石機制進行了化學純三聚氰胺膀胱結石大鼠模型的研究，實驗結果顯示，以每日給藥0.5、0.7、0.9 g/kg劑量組在第30日時形成膀胱結石比例最高，且均為雄性大鼠，這和臨床上泌尿系結石多發生在男性患者的情況相符，主要是因為男性尿道與女性尿道的生理構造不同，相對于女性而言，男性尿道較長而窄，易形成結石。此實驗結果表明，化學純三聚氰胺易使大鼠形成膀胱結石，并且每日0.5 g/kg是一個比較理想的建立大鼠膀胱結石模型的劑量。

1.3三聚氰胺致輸尿管結石的動物模型鄒移海等[20]觀察三聚氰胺連續給藥20 d誘發SD大鼠膀胱結石的情況，實驗分為6組，其中5組為給藥組，另1組為空白對照組；采用體視顯微鏡觀察到各組大鼠給藥第20日輸尿管結石發生率為93%，且以0.5～2.5 g/kg三聚氰胺連續給藥20 d，易誘發部分SD大鼠產生輸尿管結石。張薇[22]的研究也證實，三聚氰胺可誘發SD大鼠輸尿管結石形成；實驗還發現，各組大鼠在給藥第10日、第20日時膀胱結石發生率為9%、37%,且給藥第20日各組大鼠輸尿管結石發生率為93%；實驗說明，高劑量三聚氰胺連續給藥不僅誘發大鼠產生輸尿管結石，還可出現膀胱結石甚至于腎臟形成沉淀物，最終導致腎臟出現結石。這一高劑量三聚氰胺可使泌尿系統各部位發生結石的研究結果與Ogasawara等[23]的實驗結果相似。

2三聚氰胺腎結石動物模型與傳統的腎草酸鈣結石動物模型的比較

傳統的尿結石動物模型主要有草酸鈣結石模型、磷酸鈣結石模型、尿酸結石模型等[24]。Robertson等[25]早在1978年就提出了泌尿系結石形成危險因子的概念,含鈣結石有尿鈣、尿草酸、尿pH、尿酸、尿量和尿酸性黏多糖6項危險因子。在泌尿系結石中，大多為草酸鈣結石，對于草酸鈣結石，其危險因子主要為尿鈣和尿草酸[24]。長期大量攝入三聚氰胺以及尿草酸都可引起泌尿系結石(如腎結石、膀胱結石)，并且損傷泌尿系統，但兩者導致尿結石的動物模型在造模方面、引起的動物泌尿系統損害、結石晶體性狀方面是有差異的，而又以致腎結石模型較為顯著[22-25]。

2.1造模方面腎草酸鈣結石造模方法包括增加尿草酸排泄量和損害腎小管上皮兩大類。目前大鼠腎草酸鈣結石模型造模的基礎誘石劑是乙二醇，因為乙二醇有增加尿草酸排泄的作用[24]。研究表明，腎小管細胞的損害有利于晶體的滯留及生長，使用腎小管上皮細胞毒性劑有利于造模；而氯化銨是常用的腎毒性藥物，長期服用可造成腎小管功能損害，促使草酸鈣晶體形成[26]。因此，在設計腎草酸鈣結石動物模型時不僅要形成高草酸尿，而且要使草酸鈣晶體滯留在腎臟。de Water等[27]乙二醇+氯化銨聯用給大鼠灌胃28 d后發現，腎皮質、髓質有晶體沉積。另外，草酸結晶的形成另一必需要素為尿鈣的排泄增加，輔以其他一些誘因(如高鈣飲食)以促使大鼠形成腎結石[24]。甘澎等[28]用乙二醇+氯化銨給大鼠灌胃，并聯合應用葡萄糖酸鈣腹腔注射后，成石效果優于乙二醇+氯化銨以及乙二醇+葡萄糖酸鈣腹腔注射。而三聚氰胺腎結石在造模方面無需添加腎毒性藥物及輔以高鈣飲食，采用不同劑量三聚氰胺灌胃實驗動物，聯合其類似物三聚氰酸灌胃，低劑量及高劑量三聚氰胺連續灌胃都可形成腎結石，但研究所選用的劑量過大會造成腎毒性較大導致動物死亡快，從而影響動物模型的建立[19-21]。

2.2腎臟損害方面de Water等[27]用乙二醇+氯化銨給大鼠連續灌胃28 d后，觀察到腎皮質、髓質有大量草酸鈣晶體沉積，而且有腎小球硬化、腎小管萎縮，還有間質纖維化等腎臟損害。國內亦有研究者用乙二醇聯合氯化銨給大鼠灌胃28 d后，觀察到大鼠腎臟可見炎性細胞浸潤及腎組織變性壞死[28]。國內還有學者用三聚氰胺及其類似物每日121 mg/kg、181 mg/kg劑量灌胃1周，可引起大鼠血肌酐、尿素氮高于參考值范圍；并且觀察到腎臟有結晶形成，結晶體阻塞腎小管，從而導致動物出現急性腎功能不全；且用每日181 mg/kg劑量灌胃的大鼠腎臟纖維增生、炎性細胞浸潤及腎小球破壞的病理表現更為嚴重[7]，其原因可能與晶體形成較大造成了腎小管的撕裂有關[29]。沉積在腎臟的晶體會逐漸積聚增大，會嚴重堵塞腎小管，進而造成腎單位的破壞甚至會引起急性腎衰竭[7]。

2.3晶體性狀有研究用乙二醇+氯化銨給大鼠灌胃，并聯合應用鈣劑腹腔注射造模的草酸鈣結石模型，14 d后對腎組織蘇木精-伊紅染色用顯微鏡觀察到，腎皮質、腎髓質、腎乳頭有大量無色透明結晶體形成，形狀不規則且折光性較強，團簇狀沉積甚至聚集成片[28]。而曹正國等[30]的研究發現，對鼠腎組織常規病理切片HE染色后，草酸鈣晶體在鏡下顯示為不規則的淡藍色晶體；Von-Kossa′s染色后，草酸晶體呈現黑褐色。柴瑋杰等[31]進行了三聚氰胺致大鼠腎損傷模型的研究，觀察到模型組在低倍鏡下可見腎組織散在點、片狀棕褐色結晶；高倍鏡下可見結晶系為扇形或圓形結構呈放射狀排列。

3小結

三聚氰胺尿結石動物模型是研究尿結石形成的重要手段，長期大劑量攝入三聚氰胺不僅可導致泌尿系結石，還可引起泌尿系統的損害，尤其是對腎臟損傷最大，甚至會造成腎衰竭。通過對三聚氰胺尿結石動物模型的研究有助于了解三聚氰胺的危害及尿結石形成過程，為篩選防治結石藥物、確定防治計劃及改善預后等提供幫助。但目前如何有效治愈三聚氰胺泌尿系結石、延緩泌尿系結石的復發并預防其形成，仍是一個亟待解決的問題。這不僅需要醫學還需要動物學、生物學和化學等學科的研究工作者共同努力。

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Research Progress in Animal Model of Urinary Calculi Caused by Melamine

SHIHong-xia1,YANGShu-fen2,ZHANGChang-rong2,LUChen2.

(1.DepartmentofGraduate,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China; 2.DepartmentofNephropathy,People′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001,China)

Absract：The infant urinary calculi caused by melamine contaminated infant milk powder occurred in China in September 2008 has aroused the public attention on the safety and toxicology of melamine.A large number of domestic and foreign studies found that long-term intake of large doses of melamine not only can cause urinary calculi,but also can result in abnormal kidney function and even kidney failure.To establish animal model of melamine is an effective method to study the disease etiology,pathogenic mechanism,and develop therapeutic regimens.Here is to make a review of the literature on the characteristics of the animal models of melamine-induced urinary calculi and kidney calculi.

Key words：Melamine； Calculi； Animal model

收稿日期：2014-04-10修回日期：2014-08-05編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.007

中圖分類號：Q95-33

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)04-0593-03

基金項目：新疆維吾爾自治區科技計劃項目(200933121)
(1.石河子大學醫學院研究生處，新疆 石河子832000； 2.新疆維吾爾自治區人民醫院腎臟病科，烏魯木齊830001)