核磁共振檢測血清代謝物組在原發性膽汁性肝硬化中的應用

蘇　蘭,楊　婧，唐映梅(綜述)，楊晉輝(審校)

(昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰內科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)

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核磁共振檢測血清代謝物組在原發性膽汁性肝硬化中的應用

蘇蘭△,楊婧，唐映梅(綜述)，楊晉輝※(審校)

(昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰內科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)

摘要：原發性膽汁性肝硬化(PBC)目前發病機制尚不明確。臨床上很多患者的診斷仍主要靠肝組織活檢，迫切需要尋找更簡便可靠的診斷方法。應用核磁共振(NMR)技術檢測PBC患者血清代謝物組，在近年來得到飛速發展。但該技術尚未成熟，目前未廣泛應用于臨床。該文就代謝組學的概況、NMR檢測血清代謝物組的相關研究進展及其在PBC診斷中的應用予以綜述，為該技術應用于臨床做準備。

關鍵詞：原發性膽汁性肝硬化；核磁共振；血清代謝物組

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性肝內膽汁淤積性肝病，病因不清，調查顯示PBC的發病率有逐年上升的趨勢，且該病預后不良，從出現癥狀到死亡或行肝移植的平均時間為5～10年[1]。根據美國肝臟病學會2009年修訂的PBC診療指南，目前PBC的診斷依據主要有：①血清生化檢查提示膽汁淤積，肝源性血清堿性磷酸酶升高和(或)γ-谷氨酰轉移酶升高；②抗線粒體抗體陽性；③病理學證據:肝組織學活檢示非化膿性膽管炎和小葉間膽管梗阻，在排外其他原因引起的膽汁淤積后，具備以上3個條件中的2項即可診斷為PBC[2]。從以上標準可以看出，對于抗線粒體抗體陰性的患者，其最終確診不得不依賴肝臟病理分析，但其高風險性和有創性的特點限制了其在PBC診斷中的廣泛開展。所以，有必要重新尋找更簡單、可靠的疾病診斷標志物。現就核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)檢測血清代謝物組在PBC中的應用進展予以綜述。

1代謝組學研究概況

代謝組學是在1999年，由Nicholson等[3]提出，并將其定義為以動物的液體和組織為研究對象，研究生物體對病理生理刺激或基因修飾產生的代謝物質質和量的動態變化，關注的對象為相對分子質量<1000的小分子化合物。Fiehn[4]將代謝組學按照研究目的不同分為4類：代謝物靶標分析、代謝輪廓(譜)分析、代謝組學、代謝指紋分析。與傳統的代謝研究不同，代謝組學研究更為全面，其從整體上研究生物樣本中全部的代謝組分，目前已應用于植物、分子表型、功能基因組學、藥物毒性、藥物療效、分子病理學及疾病的診斷等許多領域[5]。與較早出現的基因組學和蛋白質組學相比，代謝組學與生理學的聯系更加緊密。疾病導致機體病理生理變化過程，可引起代謝產物發生相應的改變，通過對正常人和患者的某些代謝產物進行分析，可尋找疾病的生物標志物，這將為疾病的診斷提供更好的方法。代謝組研究的一個重要部分是比較分析健康狀態與疾病狀態下小分子代謝物表達的差異，這有助于人們尋找各種疾病早期診斷的生物標志物，并可用于疾病預后及治療效果的評判。代謝組學研究的優勢在于：①代謝物是基因和蛋白表達放大，使檢測更容易；②基因及蛋白表達需要全基因組測序或建立大量表達序列標簽的數據庫，而代謝組學不需要；③代謝物的種類遠小于基因和蛋白的數目，這在檢測上更簡便；④生物體液的代謝物分析可反映機體系統的生理或病理狀態；⑤不同生物體內的代謝成分是一樣的，使代謝組學技術具有更好的通用性[6]。完整的代謝組學分析流程主要包括樣品采集及預處理、數據采集及預處理、多變量數據分析、目標物識別和研究結果的解釋與應用等步驟，代謝組學研究最常用的樣本有尿液、血清或血漿[7]。研究中較常用的方法包括NMR、氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用，幾種方法各有優缺點：①NMR是一種基于具有自旋性質的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻而產生能躍遷的譜學技術；NMR技術對樣品的需要量少，幾乎不需要對樣品進行前處理，且NMR方法還能提供豐富的代謝產物的結構、濃度、分子動力學及相互作用等分子信息；而NMR技術最大的不足在于靈敏度低、分辨率不高，隨著近年來技術的改進，上述缺點將逐漸被改進[8]；②氣相色譜-質譜聯用技術適宜分析小分子、熱穩定、易揮發、能氣化的化合物，氣相色譜-質譜聯用操作前需要對樣品進行衍生化處理，衍生化預處理不僅費時且其過程會丟失某些物質的信號[9]；③液相色譜-質譜聯用可分析高極性、更高相對分子質量及熱穩定性差的化合物，超高效液相色譜飛行時間質譜聯用技術是近年發展起來的一種對分析復雜樣品很有效的方法[10]。與NMR相比，后兩種技術在操作、樣品要求及費用上要求均較高。近年來，為實現各類代謝物的高分辨、高通量分離分析，在有關色譜分離模式的選擇、超高效/高壓液相色譜系統開發以及多維色譜技術等方面都開展了大量的研究。

2NMR在血清代謝組學研究中的應用

NMR是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發生塞曼分裂，讓處于外磁場中的自旋核接受一定頻率的電磁波輻射，當輻射的能量恰好等于自旋核兩種不同取向的能量差時，處于低能狀態的自旋核吸收電磁輻射能躍遷到高能狀態，這種現象稱為NMR[11]。NMR于20世紀70年代初開始應用于生物醫學的研究，并于此后得到飛速發展。利用高分辨率NMR技術對完整器官或組織細胞內許多微量代謝組分進行檢測，可得到相應的生物代謝信息。NMR方法的如下特點使其成為代謝組學中最為普遍研究手段：①對樣品的結構和性質無損傷性；②能在接近生理條件下進行實驗，實驗條件更容易實現；③可研究化學交換、擴散及內部運動等動力學過程，給出信息較豐富，且為動態性；④可設計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣[12]。樣品進行NMR技術檢測前幾乎不需要進行處理，操作過程快速，可使用極少量的樣本獲得大量信息。

目前常用的NMR技術有氫譜、碳譜及磷譜3種，因氫譜對含氫化合物均有響應，能完成樣品中大多數化合物的檢測，滿足代謝組學中對盡可能多的化合物進行檢測的目標，所以氫譜應用最為廣泛。早期的工作主要應用氫譜技術分析哺乳動物的尿液和體液樣本。Tréhout等[13]采用高通量NMR技術，對缺血性肝衰竭導致肝性腦病的豬動物模型進行了生物人工肝支持系統治療前后的血漿代謝組學分析，發現經海藻鹽包被原代豬肝細胞生物人工肝治療的肝衰竭豬的血漿膽堿、氧化三甲胺峰值較僅進行血漿置換治療組下降，生存時間也較長。Yang等[14]應用高分辨魔角旋轉氫譜技術對人肝細胞性肝癌進行檢測，同時與正常肝組織對比，腫瘤組織中乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、胱氨酸、膽堿代謝物、磷酸乙醇胺等水平均明顯升高，而三酰甘油、葡萄糖、糖原等水平明顯下降；使用同樣的方法在非肝硬化組織、肝硬化組織及低分化腫瘤組織進行檢測，發現不同疾病狀態下肝組織的代謝物也各有不同。Martínez-Granados等[15]采用高分辨力的磁共振波譜研究慢性肝炎引起的肝硬化患者離體肝活檢組織，結果提示，慢性肝炎引起的肝硬化患者離體肝活檢組織中谷氨酸、磷脂乙醇胺、磷酸膽堿、不飽和脂肪酸這4種代謝物較正常肝組織升高，而谷氨酰胺、天冬氨酸、游離膽堿和葡萄糖這4種代謝物則較正常低，并且發現谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖似乎與肝硬化分期相關。Yap等[16]在研究甲烯酸丙酯誘導的大鼠肝毒性實驗時，用高分辨力的磁共振波譜對肝毒性大鼠的肝臟進行測定，用氫譜對血漿和尿樣進行測定，進而通過主要成分分析法發現脂類成分在肝組織中含量明顯增高，這一結果與在血清中發現的脂類成分含量降低相吻合。

3代謝組學在PBC中的應用

疾病的發生會引起機體產生相應的代謝變化，通過代謝組學的研究，找出相關代謝標志物并建立科學的診斷模型，對于疾病診斷和分型將提供許多幫助。2002年，Brindle等[17]首先報道了應用代謝組學技術研究心血管疾病患者的血清和血漿的NMR譜圖，并提出了判別心血管疾病及其嚴重程度的新診斷方法。肝臟是人體最主要的代謝器官，是三大物質代謝的樞紐，肝臟如果有病理生理改變，與之相關的代謝就會產生相應的變化，這時可以通過分析代謝產物成分，得到與肝臟病理生理過程相關聯的生物學信息。代謝組學研究起步開始，就在肝病領域進行了大量研究。Robertson等[18]采用NMR和模式識別技術快速進行肝腎內毒性物質的代謝組學評價，同時使用四氯化碳、α-奈基異硫氰酸鹽兩種化合物制造肝臟損傷模型，發現了不同時間點的代謝物譜特征，提出代謝物特征可預測肝損模型嚴重程度的觀點，并設想可作為預測指標。Van等[19]曾對肝硬化患者的肺泡氣進行了對比研究，發現肝硬化患者的呼氣中二甲硫醇以及部分酮體的水平明顯升高，且二戊酮的水平與肝臟損害的嚴重程度呈正相關。Qi等[20]利用NMR方法分析肝硬化與肝癌細胞患者的血清代謝輪廓，得出了與上述相同的結論，發現兩者的醋酸、丙酮酸等9種代謝物水平高于健康對照組，而低密度脂蛋白、異亮氨酸等7種代謝物水平低于對照組。連江山[21]利用線性梯度的超高效液相色譜飛行時間質譜技術研究發現，不同原因肝硬化患者血清中油酰胺和十四酰胺濃度的變化不同，這些脂肪酸酰胺在酒精性肝硬化患者血清濃度增加，但在乙型肝炎引起的肝硬化患者血清濃度降低。雖然各種原因引起的肝硬化病因不同，但均導致了彌漫性纖維化和再生結節的相同病理結局。PBC典型的病理改變可分為4期：膽管炎期、膽管增生期、纖維化期、肝硬化期，不同階段肝組織的病理改變必然會影響肝臟在機體新陳代謝中的作用。近年來，關于PBC代謝組學的研究仍較少，劉薇[22]運用以液相色譜-質譜為基礎的血液代謝組學研究方法對自身免疫性肝炎和PBC患者進行了血液代謝組學的初步研究，通過研究其與正常人間的血液代謝譜差異，鑒定出了膽汁酸、溶血卵磷脂等5類生物標志物。周豪[23]采用超快液相色譜-串聯質譜聯用的技術，建立以超快液相色譜-串聯質譜聯用為基礎的代謝組學研究平臺，發現了三酰甘油、磷脂酰膽堿等21種PBC的生物標志物。Trottier等[24]使用液相色譜法發現，PBC及原發性硬化性膽管炎患者的總膽汁酸、甘氨酸、牛磺酸均高于健康對照組。因此，盡管國內外關于PBC代謝組學的研究仍較少，但借鑒上述不同類型肝硬化以及肝癌的代謝組學研究思路，向PBC代謝組學研究領域擴展，相信其將為研究自身免疫性肝病發病機制提供一個新方法，為臨床診斷提供新的思路。

4小結

代謝組學作為一門新興的學科，其發展非常迅速。目前，代謝組學技術在PBC診斷的應用研究尚處于初步階段。由于患病生物體內的所有小分子代謝產物都可被檢測，提示可以尋找更多的可能生物標志物達到早期診斷、早期治療的目的。NMR為非侵入操作，且不破壞樣本，是現有代謝組學分析技術中唯一能用于活體和原位研究的技術[25]。相信隨著分析手段和數據分析方式的不斷完善，NMR的代謝組學在PBC的診斷、治療以及預后判斷將發揮更廣泛的作用。

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Application of NMR in the Detection of Serum Metabolites Group of Primary Biliary CirrhosisSULan,YANGJing,TANGYing-mei,YANGJin-hui.(DepartmentofHepatology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanCenterfortheStudyofLiverDiseases,Kunming650031,China)

Abstract:Primary biliary cirrhosis(PBC) pathogenesis is not clear at present,and the diagnosis of many patients still mainly relies on liver biopsy,so there is an urgent need to find a more convenient and reliable diagnostic method.Using nuclear magnetic resonance (NMR) to detect serum metabolites group in patients with PBC is a rapid development in recent years,though the technology is not yet mature,and not widely used in clinical practice currently.Here is to make a review of metabolomics research progress related to serum metabolomic NMR and its application in the diagnosis of PBC to prepare for the clinical application of the technology.

Key words:Liver biliary cirrhosis； Nuclear magnetic resonance； Serum metabolites

收稿日期：2014-07-15修回日期：2014-10-12編輯：鄭雪

基金項目：云南省科技計劃項目聯合專項(2010CD170)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.045

中圖分類號：R575

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-2042-03