缺血后處理對大鼠腎缺血/再灌注損傷及p38MAPK活性的影響

李　濤，王雪巖，姜秀良，梁立升，李愛芝，馬宏仲，馬加?！?/p>

(1.青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院麻醉科，山東 煙臺264000； 2.煙臺市疾病預防控制中心，山東 煙臺264000)

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缺血后處理對大鼠腎缺血/再灌注損傷及p38MAPK活性的影響

李濤1△，王雪巖2，姜秀良1，梁立升1，李愛芝1，馬宏仲1，馬加海1※

(1.青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院麻醉科，山東 煙臺264000； 2.煙臺市疾病預防控制中心，山東 煙臺264000)

摘要：目的研究缺血后處理(IPO)對大鼠腎缺血/再灌注損傷(IRI)及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性的影響。方法將24只SD大鼠依據隨機數字表法分為3組,各8只。對照(S)組：僅結扎右側腎蒂，左腎蒂游離；缺血/再灌注(IR)組：結扎右側腎蒂，夾閉左側腎蒂60 min后，開放灌注24 h；IPO組：腎臟缺血60 min后，進行10 s灌注、10 s阻斷，共6個循環的IPO，然后開放灌注24 h，余同IR組。檢測血尿素氮(BUN)、肌酐，酶聯免疫吸附試驗法檢測腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)水平，Western blot法檢測腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達，觀察腎組織的病理學變化。結果與S組比較，IR組和IPO組血BUN、肌酐，腎TNF-α、IL-1、p38MAPK蛋白表達量及組織病理評分顯著增加(P<0.05)；IPO組各指標較IR組顯著下降(P<0.05)。結論IPO能減輕腎IRI，其機制與抑制p38MAPK活化，進而抑制炎性因子釋放有關。

關鍵詞：缺血/再灌注損傷；腎臟；缺血后處理；p38絲裂原活化蛋白激酶

腎臟缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是引起急性腎衰竭的重要原因之一，缺血后處理(ischemic postconditioning，IPO)是一種新的減輕器官IRI的方法，可操作性強，對心、腦等器官IRI有確切的保護作用[1-2]，但對腎臟IRI的研究結果不一，機制尚不明確。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是MAPK的一個亞類。研究發現，腎臟IRI后p38MAPK活化，進而調節腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1(interleukin 1,IL-1)等炎性細胞因子釋放增加，導致腎臟損傷[3]。本研究擬探討IPO對大鼠腎臟IRI及p38MAPK活性的影響。

1材料與方法

1.1材料選擇清潔級健康8~ 10周SD雄性大鼠(購自煙臺綠葉實驗動物中心)24只，體質量210～240 g，動物許可證號SYXY(魯)20030020。所有動物實驗前12 h禁食，自由飲水。依據隨機數字表法分為3組：對照(S)組、缺血/再灌注(IR)組、IPO組，每組8只。

1.2方法以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，將所有大鼠麻醉后固定于操作臺上。S組：尾靜脈輸注生理鹽水，腹部正中切口進入腹腔，小心分離出雙側腎蒂，僅結扎右側腎蒂，左腎蒂游離。IR組：結扎右側腎蒂，用無損傷微動脈夾夾閉左側腎蒂60 min后，松開動脈夾后充分開放灌注24 h，腎臟由暗紅色恢復鮮紅色即可確認血流恢復。IPO組：腎臟缺血60 min后，進行開放灌注10 s、阻斷10 s 共6個循環的IPO，然后充分開放灌注24 h。

1.3標本留取再灌注24 h后，從下腔靜脈抽取靜脈血2～4 mL置于抗凝管內，靜置4 h后分離血清，-70 ℃保存待用。分離左側腎臟，濾紙吸干表面水分，將腎臟縱剖后取腎皮質100～200 mg，精確稱重后用剪刀剪碎移入勻漿管內按溶質質量/溶液體積=1/9的比例加入4 ℃生理鹽水，在冰浴中進行勻漿，制備成100 mg/L的腎組織勻漿液，以4 ℃低溫離心機離心后取上清液于液氮速凍后置于-70 ℃冰箱中保存待用。同時摘取部分左腎組織置于4%多聚甲醛固定。

1.4檢測指標采用全自動生化分析儀(Siemens-ADVIA2400)常規生化分析法測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測腎組織勻漿(上清)TNF-α、IL-1水平。Western blot法檢測腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達。通過AlphaEase FC軟件分析蛋白相對表達量，以β肌動蛋白為內參照，膠片掃描并照相，測定各條帶A值。以目的蛋白和β肌動蛋白條帶A值之比反映p38MAPK蛋白表達程度。左腎組織常規石蠟包埋，常規制片蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡觀察病理變化，按照Jablonski等[4]描述的病理分級法將組織損傷程度分為0～4級。0級:正常；1級:單個細胞的壞死伴核分裂；2級:相鄰近曲小管所有細胞壞死，但周圍小管存活；3級:限定于近曲小管遠端1/3細胞的壞死并擴展到皮質和髓質交界處；4級:近曲小管整段壞死。

2結果

2.1各組大鼠血清BUN、肌酐和腎組織TNF-α、IL-1水平的變化與S組比較，IR組和IPO組血BUN和肌酐水平顯著增加(P<0.05)；與IR組比較，IPO組血BUN和肌酐水平顯著下降(P<0.05)。 與S組比較，IR組和IPO組腎組織TNF-α、IL-1水平顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，IPO組TNF-α、IL-1水平顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清BUN、肌酐和腎組織

BUN：血尿素氮； TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1：白細胞介素1；S組:對照組；IR組:缺血/再灌注組；IPO組：缺血后處理組；a與S組比較，P<0.05；b與IR組比較，P<0.05

2.2腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達及病理分級IR組和IPO組p38MAPK蛋白相對表達量顯著高于S組(P<0.05)，IPO組p38MAPK蛋白相對表達量顯著低于IR組(P<0.05)。與S組比較，IR組和IPO組腎組織病理分級升高(P<0.05)；與IR組比較，IPO組病理分級下降(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠腎組織磷酸化p38MAPK

p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；S組:對照組；IR組:缺血/再灌注組；IPO組：缺血后處理組；a與S組比較，P<0.05；b與IR組比較，P<0.05

2.3腎組織病理學改變光鏡下S組腎小球、腎小管結構正常(圖1A)；IR組見明顯腎組織病理學損傷，主要表現為腎小管上皮細胞脫落、基膜斷裂和腎小管阻塞，間質有水腫、充血及炎性細胞浸潤(圖1B)；IPO組腎臟組織學改變輕微，僅見少數腎小管上皮細胞空泡變性、部分管腔擴張、淋巴細胞浸潤(圖1C)。

圖1　各組SD大鼠腎臟缺血/再灌注后處理的光鏡下形態學改變(HE染色,×100)　A：對照組；B：缺血/再灌注組；C：缺血后處理組

3討論

本研究采用先結扎右側腎蒂，夾閉左側腎蒂60 min再灌注24 h制備腎臟缺血再灌注損傷模型，避免對側腎的代償作用。BUN、肌酐能密切反映腎細胞的受損情況，本研究中IR組肌酐、BUN水平明顯升高，腎組織損傷嚴重，說明成功建立腎IRI模型。

急性缺血是急性腎衰竭的最常見原因，再灌注加重腎損傷，如何有效地減輕腎臟IRI是目前研究的熱點。IPO能否發揮保護作用，最關鍵的影響因素有兩個：循環次數和短暫復灌/缺血的持續時間。有學者研究了不同IPO方案抗大鼠腎IRI的作用，認為6個循環10 s灌注/10 s阻斷的方案最佳[5]。因此本研究采用了此方案。結果表明，IPO組血清BUN和肌酐水平較IR組顯著降低，組織損傷亦減輕，說明IPO保護了腎臟的組織結構與功能。腎臟IRI機制十分復雜，近年來白細胞聚集及急性期反應的一些細胞炎性因子的作用日益受到重視，已證實腎缺血時，腎組織局部可產生多種炎性介質，其中包括TNF-α、IL-1、IL-6等[6]。本研究結果顯示，IRI后腎組織TNF-α、IL-1水平也明顯增加，提示IRI后炎性因子釋放可能是導致腎臟組織結構與功能損傷的重要原因。

研究認為，IPO的作用機制主要包括：氧自由基的生成減少，腺苷、一氧化氮等內源性活性物質的釋放及ATP敏感性鉀通道等[7-8]。p38MAPK信號通路是近年來發現的廣泛存在于各種動物細胞中的一條信號轉導通路，p38MAPK產生于胞質，可被多種胞外刺激激活，激活后移位入核而發揮作用[9]。有研究證明，p38MAPK信號通路參與IRI等多種因素所致炎癥反應調控，缺血/再灌注期間，p38MAPK活化，單核巨噬細胞、中性粒細胞等被激活后釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細胞因子，后者通過多種途徑參與細胞的損傷，而阻斷p38 MAPK信號通路能減輕腎臟IRI[10]。本研究結果顯示，腎IRI后磷酸化p38MAPK蛋白的表達水平升高，而IPO組表達水平降低，提示IPO能抑制大鼠腎臟IRI后p38MAPK的活化，減少TNF-α、IL-1等炎性因子的釋放，降低炎癥反應程度，從而保護腎臟的組織結構與功能。

綜上所述，IPO能減輕腎臟IRI，其機制與抑制腎臟IRI后p38MAPK活化，從而抑制炎癥反應有關。

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Effects of Ischemic Postconditioning on Ischemia Reperfusion Injury and Expression of p38MAPK Protein in Rat KidneyLITao1,WANGXue-yan2,JIANGXiu-liang1,LIANGLi-sheng1,LIAi-zhi1,MAHong-zhong1,MAJia-hai1.(1.DepartmentofAnesthesiology,YantaiYuhuangdingHospital,QingdaoUniversityMedicalCollege,Yantai264000,China； 2.YantaiCenterforDiseaseControlandPrevention，Yantai264000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning on ischemia reperfusion injury(IRI)and expression of p38 mitogen-activated protein kinase(p38MAPK) protein in rat kidney.MethodsA total of 24 SD rats were allocated randomly into 3 groups(n=8 per group).Sham (S) group:rats received continuous intravenous infusion of normal saline and clamping the right renal pedicles.IR group(IR):renal IRI was induced by clamping both renal pedicles 60 minutes followed by 24 h reperfusion.Ischemic postconditioning(IPO) group:ischemic postconditioning was given six cycles of 10 s reperfusion/10 s occlusion followed by 24 h reperfusion.Serum blood urea nitrogen(BUN), creatinine(Cr) was detected.ELISA was used to detect the tumor necrosis factor α (TNF-α),interleukin 1 (IL-1) in kidney.Western blot was applied to detect the expression of p38MAPK protein.Renal histopathology lesions were also examined.ResultsCompared with group S,the serum BUN and Cr,renal TNF-α and IL-1,expression of p38MAPK protein increased significantly in group IR and group IPO(P<0.05).Compared with group IR,all indexes in group IPO decreased significantly(P<0.05).ConclusionIPO can attenuate renal IRI in rats.The mechanism is related to inhibition of p38MAPK expression and inflammatory factor release.

Key words:Ischemia reperfusion injury; Kidney; Ischemic postconditioning; p38 mitogen-activated protein kinase

收稿日期:2013-07-01修回日期:2014-10-23編輯：伊姍

基金項目：煙臺市科技發展計劃項目(2009155-12)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.048

中圖分類號：R692.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-2049-03