Ts-SV40介導的溫敏細胞研究現狀

廖余平，李曉紅，孫洪濤

綜述

Ts-SV40介導的溫敏細胞研究現狀

廖余平，李曉紅，孫洪濤△

非永生化細胞在體外的傳代次數、增殖活性是有限的，在應用于細胞治療或者是體外研究中會受到細胞數量的限制。轉染有ts-SV40LT基因的細胞在許可溫度下具有最大的增殖活性，在許可溫度進行細胞擴增能彌補細胞數量不足的限制，非許可溫度可用于細胞治療或研究其生理特性。其研究領域涉及腹膜的間質細胞、泌尿道肌衛星細胞、口腔上皮細胞、腎上腺髓質細胞、骨髓血管內皮細胞、視網膜祖細胞、間充質干細胞、造血干細胞、肥大細胞、足細胞、庫普弗細胞等。本文對ts-SV40介導的溫敏細胞的研究現狀做一綜述。

轉染；低溫，人工；綜述；ts-SV40；溫敏細胞；亞低溫；永生化

溫度敏感猿猴病毒大 T抗原（temperature sensitive simian virus 40 large T antigen，ts-SV40LT）在許可溫度下能促進細胞增殖，在非許可溫度則抑制細胞增殖。在應用細胞移植治療過程中，轉染有ts-SV40LT基因的細胞在體外許可溫度下進行擴增以彌補移植細胞不足的限制，移植到體內后在非許可溫度實現細胞或基因治療的作用。本綜述旨在概述ts-SV40LT基因的作用機制、涉及研究領域及應用。

1　研究背景

SV40屬多瘤病毒家族，是20世紀60年代初由Sweet和Hilleman從猴腎細胞中分離得到的一種DNA病毒。SV40基因組是一條單拷貝雙鏈、環狀、超螺旋DNA，由調控區、早期編碼區和晚期編碼區3個不同的功能區組成。早期編碼區編碼3種蛋白：位于核內的LT抗原、小T抗原和17KT。合成的LT抗原蛋白98%定位于細胞核內，是具有ATP酶和DNA解旋酶活性的多功能磷酸蛋白，能夠促進宿主細胞進入S期。由于干預了細胞周期控制，LT抗原就代表了SV40的主要轉化蛋白。

非永生化細胞體外每經過一次細胞周期端粒就縮短一次，并逐漸失去分裂能力，趨向凋亡。細胞永生化是指細胞獲得持續生長增殖能力的特性，永生化細胞具有無限增殖生長的特性，可長期傳代并多伴有核型改變［1］。端粒酶的激活可使端粒長度保持相對穩定，從而使細胞獲得永生化。自然狀態下嚙齒類動物自發永生化的概率非常小，為1×10-6～1× 10-5，人類細胞發生的概率更是小于1×10-12。因此，要使用各種物理和生物因素誘導細胞發生永生化，其中SV40LT抗原是非造血細胞永生化最常用的成分［1-2］。SV40LT基因感染宿主細胞并與宿主細胞DNA穩定整合重組后能在細胞內表達SV40LT抗原，加快轉化細胞的增殖速率，同時也能保留原始細胞許多分化表型，具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，在細胞水平上可反映原始細胞的生物學特性。

2　SV40介導永生化的機制

雖然SV40是基本的病毒性致癌物質，作為永生化的常用基因片段其LT抗原基因也已被確認為癌基因，但SV40病毒引起細胞轉化和發生永生化仍然是一個復雜的過程，其機制尚不完全清楚，多認為是諸多因素共同參與和調控的結果。在諸多的因素中，p53和pRb與SV40LT抗原所介導的永生化最為密切，研究也最多。由393個氨基酸組成的核磷蛋白基因編碼的p53具有轉錄因子作用，野生型p53在細胞周期G1期停滯時能檢測DNA的完整性，并通過其過度表達誘導受損的細胞凋亡，以確保DNA復制的完整性，如果p53基因發生突變，則失去細胞周期G1檢查點功能［3］。LT抗原可以與p53結合形成復合體使p53失活，在對SV40轉化的大鼠細胞中LT抗原磷酸肽分析以及對SV40裂解性感染細胞的分析表明，游離的LT抗原與和p53結合的LT抗原有不同的磷酸化方式，最顯著的差別就是p53復合體的LT抗原不含磷酸肽。這些磷酸肽是由小鼠雙微體基因（murine double minute 2，MDM2）衍生來的，MDM2是p53拮抗劑，可能與p53-LT復合而形成p53-LT-MDM2三聚體發生共沉淀。MDM2在SV40轉化的細胞中與游離p53大量結合，而游離的LT抗原不與MDM2復合，提示MDM2蛋白與LT抗原有一個特殊的靶識別途徑。這一特殊途徑由于MDM2蛋白在正常細胞和SV40轉化細胞中顯著不同的磷酸化方式而顯得更突出。另外，與p53一樣，MDM2蛋白在SV40轉化細胞中代謝穩定，這提示通過SV40這一特殊靶識別途徑的目的在于抑制SV40轉染或轉化細胞中的由MDM2誘導的p53蛋白酶體降解，從而使這些細胞中p53代謝穩定［4］。

3　溫度敏感細胞的特征

SV40溫度敏感突變體指的是溫度依賴而發生構象改變的LT抗原基因，在許可溫度下能促進細胞增殖，在非許可溫度則抑制細胞增殖。ts-SV40LT基因包含一個單核苷酸突變而導致纈氨酸在非許可溫度發生構象改變［5-6］。

野生型SV40LT抗原通過滅活一些腫瘤抑制因子如p53、pRb等保持細胞的永生化［7-8］。ts-SV40LT是SV40LT抗原突變等位基因，許多從轉導該基因動物提取的細胞系呈現出溫度依賴的生長特點，在非許可溫度下細胞分化或生長停止而出現凋亡［9］。劉洪良等［10］認為盡管其細胞呈現溫度敏感生長特點，在非許可的39℃LT抗原及S期標志物增殖性細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的含量并沒有明顯下降。細胞周期分析提示在39℃位于G1前期時間明顯增加，代表細胞凋亡標志的S期下降，因此認為細胞的永生化及增長歸因于ts-SV40LT抗原的持續表達。

Kim等［11］利用ts-SV40LT抗原溫度敏感性特性讓細胞在37～39℃條件下培養一段時間滅活LT抗原，危機期逃逸細胞將在幾代內逐漸死亡。但仍有約0.053%～0.093%的細胞能夠進入S期，對溫度不再敏感得以繼續生存，盡管這些細胞端粒酶持續表達，端粒長度保持恒定，但染色體損傷不能避免。這就提示使用這些細胞必須謹慎，因為其在臨床應用時可能出現不可預料的表型變化。

Ts-SV40LT在許可的33℃能與p53及pRb形成復合體促進細胞增殖，但在非許可溫度，ts-SV40LT迅速被滅活并從其復合物中釋放pRB或p53［12-13］，細胞停留在G1或G2/M期［14］，劉洪良等［10，15］利用ts-SV40LT的溫度可調控特性建立一種溫度敏感的干細胞系，發現該細胞在其適宜溫度（33℃）下大部分處于S期，但當其處于37℃環境中時多停滯于G1期。這就提示在適宜溫度下細胞呈現LT抗原促進細胞增殖的特點，在非適宜溫度呈現LT抗原滅活的作用。然而，在非許可溫度細胞的分子機制仍需要進一步探索。

4　溫敏細胞目前應用

4.1間皮細胞的腹膜損傷修復研究隨著腹膜透析的廣泛推廣，由此產生的腹膜損傷發病率也增高，間葉細胞移植治療可能是一種有效的治療方法。Kanda等［16］通過ts-SV40轉基因大鼠建立溫敏間葉細胞系進行了誘導間葉細胞向成纖維細胞分化的研究，該細胞系在33℃呈現細胞增殖活性，于38℃環境培養時細胞增殖停止并趨向分化，不僅實現了細胞表型的改變，也實現了成纖維細胞的生物作用，該研究發現間充質干細胞自身分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有成纖維化及趨化作用，但間充質干細胞移植治療腹膜損傷的安全性及有效性有待進一步評估，其中就包括腹膜原位移植間充質干細胞的數量或次數探索［5］。

4.2誘導泌尿道括約肌衛星細胞肌源性分化研究前列腺切除術后尿道括約肌損傷易導致尿失禁。Sumino等［17］研究不同生長因子對泌尿道括約肌衛星細胞分化的影響。將人肌衛星細胞轉導ts-SV40LT后于33℃環境下培養進行細胞擴增，在39℃誘導其分化。其研究發現肝細胞生長因子（hepatocyte growth，HGF）不能誘導衛星細胞的肌源性分化，胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）通過PI3-K途徑誘導衛星細胞分化為肌源性細胞［18］。這些發現提供了一種可能的新方法，即利用肌衛星細胞用于尿失禁治療。

4.3鼠科口腔上皮細胞增殖的分化研究上皮組織具有分隔外界環境，保護組織不受外界病菌侵入的作用。Tabuchi等［19］通過轉導有ts-SV40基因胎鼠建立永生化的口腔上皮細胞系，其細胞在33℃或中間溫度37℃呈現出細胞增殖的特點，在非許可的39℃增殖停止并呈現凋亡的跡象。組織學及免疫組織化學分析表明細胞在37℃具有分層上皮樣細胞形態改變特點，免疫分析表明其細胞表達有口腔上皮細胞特異性標記的多層鱗狀角化蛋白。可以預期這個細胞系將被用作體外模型研究如上皮細胞生理學功能、口腔上皮基因表達及上皮組織修復研究。

4.4腎上腺髓質細胞向神經元細胞的分化誘導Murata等［20］利用轉染有ts-SV40基因的大鼠建立了一個腎上腺髓質細胞系，細胞在33℃的許可溫度時在膠質細胞神經源性生長因子（glial cell line-derived neurotropic factor，GDNF）等營養因子的作用下細胞數增長。非許可的39℃時在GDNF等營養因子的作用下分化為神經元樣細胞。其研究表明，轉基因細胞在溫度變化時，可將其癌基因滅活，并在GDNF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的同時作用下具有終末分化為神經元樣細胞的能力。該細胞系提供了一個實用的可用于神經元分化調節機制研究的系統模型。

4.5骨髓血管內皮細胞向血管組織的分化組織內皮細胞移植修復主要考慮從大血管如臍靜脈分離及培養內皮細胞。然而，這些細胞模型的建立尚存在某些限制，例如與預期壽命相比其增殖潛力有限，在功能表現上具有易變性。Hattori等［21］從ts-SV40轉基因鼠骨髓分離單核細胞后于37℃將其誘導為分化型內皮細胞（endothelial cells，ECs），接下來轉移到ts-SV40LT許可的33℃培養基進行培養，通過RT-PCR可檢測到VEGF、VEGF受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血管性血友病因子（von Willebrand，vWF）的分泌表達。應用ts-SV40轉基因大鼠提取的各種細胞將可能用于檢測內皮細胞與器官或組織的相互作用，并可能通過這些細胞作為基因治療的運載工具用于抑制或活躍血管原位再生。

4.6應用人類胎兒視網膜永生化細胞治療視網膜疾病人類胎兒的視網膜細胞被廣泛用于視網膜退行性變的細胞替代治療，其應用的一個主要缺陷就是缺乏足夠的持續細胞來滿足治療需求。Hasan等［22］利用攜帶有ts-SV40LT基因的逆轉錄病毒轉染視網膜祖細胞獲得溫敏視網膜細胞系，對該細胞系于33℃培養進行細胞擴增，于37℃誘導其分化。為了評估這些細胞與病變細胞的相容性并屏蔽其潛在的致瘤性，將其移植到新生正常鼠及視網膜病變鼠中，兩組的移植細胞表現出與受體鼠罕見的相容性，但沒有表達成熟的分化表型。盡管移植的永生化細胞呈現出較高的生存率，但其生存時間不長，最終所有的移植細胞都被巨噬細胞或小膠質細胞吞噬。這項研究表明，永生化的胎兒視網膜細胞能保持其祖細胞的特點，可能作為移植供體細胞治療視網膜退行性疾病。

4.7應用溫敏干細胞聯合亞低溫治療急性顱腦創傷（traumatic brain injury，TBI） 干細胞移植對TBI具有潛在的治療作用。然而，TBI后缺氧微環境以及毒素積累可導致移植細胞存活率不高，從而限制其臨床應用，亞低溫治療具有改善TBI后微環境的作用。Tu等［23］推測溫敏干細胞聯合亞低溫具有促進移植細胞存活的作用，尤其是在亞低溫下呈現最大活性的溫敏干細胞，在這項研究中，運用質粒攜帶ts-SV40基因轉導的間充質干細胞用于TBI治療，對大鼠認知及運動功能的改善與對照組相比更加明顯。神經干細胞移植后功能恢復需要一定的時間，需要新分化的神經元成熟并且與受體整合，但溫敏臍帶間充質干細胞分化為神經元尚需進一步研究。

4.8其他肥大細胞（mast cells，MCs）在體內廣泛分布于黏膜組織，在抵抗寄生蟲及細菌侵入時具有較高的敏感性，甚至可造成過敏反應及自身免疫性疾病。研究MCs的調控及作用機制對治療由MCs異常引起的疾病顯得尤為重要。Kanehira等［24］從轉導有ts-SV40大鼠的骨髓提取MCs，研究其在某些刺激因子作用下的細胞形態學及生物化學變化特點，促進了MCs體外分化及功能研究。Oostendorp等［25］利用ts-SV40轉基因大鼠造血基質細胞用于造血因子的表達研究，發現轉染有ts-SV40基因的胚胎干細胞的生長及克隆活性增加。Chittiprol等［26］利用ts-SV40介導永生化足細胞系研究其在不同條件下基因表達、細胞形態學特點。Herman-Edelstein等［27］利用ts-SV40介導永生化足細胞用于糖尿病腎病研究，Wang等［28］利用ts-SV40轉基因大鼠用于庫普弗細胞（Kupffer cell，KC）的體外研究，轉染有ts-SV40的KC保持了原始KC的特性，提供了一個適宜的方法評估KC在肝損傷以及慢性疾病中的角色。

5　展望

Ts-SV40在許可溫度下能促進細胞增殖，在非許可溫度下則抑制細胞增殖。利用其在許可溫度促進細胞增殖的特點，將其應用于細胞移植治療，轉染有ts-SV40LT基因的細胞在體外許可溫度下進行擴增可以彌補移植細胞不足的限制，移植到體內后在非許可溫度下實現細胞或基因治療的作用；在應用于非永生化細胞體外研究中，可通過轉染ts-SV40LT基因于許可溫度進行細胞擴增、非許可溫度研究其生理特性。其涉及研究領域廣泛，但分子機制尚不完全明確，多次傳代之后其細胞分化潛能、形態學及功能改變、潛在的致瘤性仍然是其應用的主要障礙，其安全性及廣泛應用有待進一步探索。ts-SV40轉染細胞在33℃有最大的增殖活性，與亞低溫治療的溫度相契合，可能是一個新興的研究方向。

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（2014-05-23收稿2014-11-13修回）

（本文編輯魏杰）

Research status on Ts-SV40-mediated temperature sensitive cells

LIAO Yuping，LI Xiaohong，SUN Hongtao△
Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China
△Corresponding AuthorE-mail:chenmo333@163.com

The in vitro passage number and proliferation of non-immortalized cells are limited，which restrictions cell therapy or in vitro studies.Cells transfected with temperature sensitive simian virus 40 large T antigen（ts-SV40LT）gene could show the greatest proliferation.The cells can be amplified with compensating the lack of limited number of cells under the permissive temperature.Non-permissive temperature can be used in studying the cell therapy or its other physiological characteristics.This research field involves peritoneal stromal cells，satellite cells of urinary tract，oral epithelial cells，adrenal medullary cells，bone marrow-derived endothelial cells，retinal progenitor cells，mesenchymal stem cells，hematopoietic stem cells，mast cells，podocytes and Kupffer cells.In this study，the current research on Ts-SV40-mediated temperaturesensitive cells was reviewed.

transfection；hypothermia，induced；review；ts-SV40；temperature sensitive cells；hypothermia；immortalization

Q28

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.027

國家自然科學基金資助項目（81471275，81271392，81341113）

天津，腦創傷與神經疾病研究所，武警后勤學院附屬醫院腦科醫院，天津市神經創傷修復重點實驗室（郵編300162）

廖余平（1989），男，碩士在讀，主要從事中樞神經創傷修復研究

△E-mail:chenmo333@163.com