孕婦外周血中胎兒游離DNA在產科中的應用

程麗琴(綜述)，田春芳(審校)

(1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 518041; 2.深圳市第七人民醫院婦產科，廣東 深圳 518081)

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孕婦外周血中胎兒游離DNA在產科中的應用

程麗琴1△(綜述)，田春芳2※(審校)

(1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 518041; 2.深圳市第七人民醫院婦產科，廣東 深圳 518081)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.011

通過檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA來進行無創產前診斷、妊娠相關性疾病診斷等是目前研究的熱點。在孕婦外周血中發現胎兒游離DNA主要是啟發于在腫瘤患者的外周血中發現具有腫瘤特征的游離DNA，并且證實這些游離DNA大多來自患者自身的腫瘤細胞[1]。1989年，Lo等[2]首先發現在母體血漿、血清中存在高水平的胎兒游離DNA。Rijnders等[3]通過對17例行體外受精或宮腔內人工受精的孕婦進行實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測SRY基因，發現最早在5周2 d即可檢測到SRY基因，7周時檢出率達80%，9周時檢出率達100%。現將孕婦外周血中胎兒游離DNA在產科方面的應用情況予以綜述。

1胎兒非整倍體疾病篩查

胎兒非整倍體異常是指胎兒1個體細胞內染色體的數目增加或減少1條或數條形成的染色體數目異常；常見的胎兒非整倍體異常有唐氏綜合征、13三體綜合征、18三體綜合征以及性染色體病[4]。非整倍異常可導致出生缺陷，給家庭和社會帶來沉重負擔。傳統的產前診斷方法有胚胎植入前遺傳診斷、絨毛穿刺取樣、羊膜腔穿刺、經皮臍血穿刺技術和胎兒組織活檢，這些方法都具有創傷性，有發生感染、出血、流產、死胎等風險[5](164-165)。因此，從證實母體血漿中存在胎兒游離DNA以來，胎兒游離DNA的檢測及臨床應用研究對非侵入性產前診斷技術產生了重大影響，現已應用于臨床且易被孕婦所接受。2011年，Chiu等[6]進行了753例大樣本基因測序，檢測21號染色體的靈敏度達100%，特異度達97.9%。2012年，Lau等[7]對108例孕婦血漿中游離DNA進行高通量基因測序，平均妊娠期為12周之前，共32例胎兒染色體常規核型分析證實，其中唐氏綜合征11例，18三體綜合征10例，13三體綜合征2例，先天性卵巢發育不全綜合征(也稱Turner綜合征)(45，XO)8例，克氏綜合征(47XXY)1例，檢出率提高到100%，假陽性率為0%。2012年，Bianchi等[8]利用大規模平行測序技術在2882例孕婦血漿中進行胎兒染色體非整倍體的檢測，發現唐氏綜合征靈敏度為100%(89/89)，18三體綜合征靈敏度為97.2%(35/36)，13三體靈敏度為78.6%(11/14)，單倍體X靈敏度為93.8%(15/16)；此外，還檢測出其他性染色體異常(XXX,XXY,XYY)及常染色體異常2例(16號和20號)，表明孕婦血漿中胎兒DNA檢測染色體異常靈敏度和特異度高。2013年，Huang等[9]對189例雙胎妊娠孕婦進行母體血漿DNA大規模平行測序，成功檢測出9例唐氏綜合征和1例18三體綜合征，另1例18三體綜合征為正常胎和1例18三體綜合征胎兒未能檢出，檢測唐氏綜合征的特異度為100%，對胎兒18三體綜合征的靈敏度和特異度分別為50%、100%；進一步研究表明，非侵入性產前診斷唐氏綜合征的雙胎妊娠具有高精確度，可以避免95%的侵入性產前診斷。

2單基因遺傳病篩查

單基因遺傳病是常見的出生缺陷之一，目前報道可利用孕婦外周血中游離DNA進行父源性致病基因的非侵入性產前診斷。在β珠蛋白合成障礙性貧血的檢測中，Galbiati等[10]采用微電子芯片技術對32例孕婦進行診斷，通過檢測7個常見的β珠蛋白突變得到100%的準確度和98.3%的特異度。2012年，Sirichotiyakul等[11]利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進行實時熒光定量PCR技術，檢測α珠蛋白合成障礙性貧血純合子基因突變，靈敏度為98.4%，假陽性率為20.8%，利用這一技術可以避免79.2%的α珠蛋白合成障礙性貧血純合子行侵入性產前診斷。在軟骨發育不全、肌強直性營養不良、先天性腎上腺皮質增生和囊性纖維化中也有成功檢測的報道[12]。

3胎兒性別鑒定

在孕早期通過孕婦外周血中胎兒DNA進行胎兒性別測定對排除性染色體相關疾病有重要意義，如X連鎖遺傳病，其致病基因在X染色體上，通過性別檢測可進一步判定患X連鎖遺傳病的風險，指導妊娠[5]。1989年，Lo等[2]首次應用巢式PCR技術在懷有男性胎兒的孕婦外周血中擴增出Y染色體的特異性重復序列，并提出這一技術可以作為性相關基因疾病的產前診斷方法之一。Honda等[13]在81例孕婦中得到妊娠5～10周的血清樣本，先通過常規PCR檢測，檢出男性胎兒的總靈敏度為95%，在第7周后靈敏度達100%；后用實時定量PCR檢測5周孕齡的胎兒性別，靈敏度也接近100%。2011年，Zargari等[14]從80例妊娠6～10周的孕婦外周血漿中提取胎兒游離DNA，采用巢式PCR技術對男性胎兒Y染色體單拷貝SRY基因、多拷貝DYS14和DAZ基因序列進行檢測，靈敏度為95.2%。

4胎兒血型檢測

母兒血型不合是我國新生兒溶血性疾病的主要原因。目前臨床上主要的診斷方法為夫婦血型檢查、血型抗體的測定、超聲檢查等，但最終確診尚需待新生兒期的檢查。2010年，施選性等[15]用健康孕婦血漿游離DNA檢測胎兒ABO血型，在46例樣本中，產前檢查能正確顯示胎兒血型的有38例，總檢出率為82.61%；待嬰兒出生后血清學檢測，總檢出符合率81.58%。2011年，馬紅麗等[16]對139例O型血孕婦外周血DNA檢測胎兒血型準確度分析，新生兒出生前后血型檢測符合率為94.24%(131/139)，孕中期血型檢測符合率為91.95%(80/87)，孕晚期的血型檢測符合率為98.08%(51/52)。2011年，Sedrak等[17]對90例RhD陰性孕婦進行研究，通過PCR擴增技術檢測RhD基因序列和SRY基因序列診斷胎兒RhD血型和性別，診斷出61例RhD陽性和29例RhD陰性胎兒，其中男37例，女53例；在胎兒RhD血型檢測中，妊娠前3個月靈敏度和診斷準確度分別為93.5%和91.1%，到妊娠中期分別增加到100%和97.78%；在胎兒性別鑒定中，妊娠前3個月靈敏度為95.2%，診斷準確度97.87%，到妊娠中期都增加到100%。2013年，Manzanares 等[18]通過定量PCR技術檢測8～13周妊娠的RhD陰性孕婦母體血漿中胎兒RhD基因型，與產后臍帶血表型進行比較，一致性為98.2%；其中1例假陽性和1例假陰性，檢測的特異度和靈敏度分別為97.5%和95%；RhD陰性孕婦在妊娠早期檢測可以避免不必要的產前預防。說明在妊娠早期通過孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測RhD血型是可行的、高度精確的。

5妊娠相關性疾病預測

5.1先兆早產早產兒各器官發育不完善，使其存活率下降，病殘率上升，因此有效預測并及時處理早產有重要意義。2012年，Jakobsen等[19]對876例孕婦進行大規模研究，通過篩查檢測RhD基因，用一個標準曲線來量化胎兒游離DNA的數量；發現在孕25周左右，體內高水平的胎兒游離DNA與自發性早產風險增加有關，在34周之前的早產，其孕婦外周血漿中的胎兒游離DNA水平升高15倍，認為胎兒游離DNA檢測可用來預測自發性早產，作為篩查早產的指標。

5.2妊娠期高血壓疾病妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高同時存在的一組疾病，可造成孕產婦和圍生兒死亡，但其病因和發病機制尚不明確[5](64-65)。2002年，Lau等[20]通過實時定量PCR技術檢測Y染色體上的SRY基因，發現孕婦外周血中胎兒游離DNA的水平在子癇前期組為521 gEq/mL，對照組為227 gEq/mL，差異有統計學意義(P=0.017)；在先兆子癇患者血漿中胎兒游離DNA 的半衰期為114 min，對照組的半衰期為28 min，兩者差異有統計學意義(P=0.007)；對照組在產后6 h胎兒游離DNA完全清除，有3例在產后2 h就下降為0 gEq/mL，而在先兆子癇組無產后6 h胎兒游離DNA下降為0 gEq/mL，認為胎兒游離DNA的清除可能與潛在的病理異常(血管病變等)有關。2011年，鄔晉芳等[21]應用甲基特異性PCR的原理及熒光定量PCR的方法，檢測孕婦外周血中u-maspin基因的含量，發現各孕期基因檢出含量差異有統計學意義(P<0.05)；其中中孕是早孕的4.43倍，晚孕是早孕的5.13倍，輕度子癇前期是正常晚孕的2.39倍，重度子癇前期是正常晚孕的5.78倍；由此認為，孕婦外周血中胎兒游離DNA的含量隨著孕周的增加而增加，在子癇前期患者中游離DNA含量隨著病情的加重而增加。2013年，Zamanpoor等[22]運用實時定量PCR技術檢測孕婦外周血漿中Y染色體上的SRY基因水平，進行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)基因水平定量檢測對比，發現妊娠期高血壓疾病組中期妊娠平均游離DNA水平(6.72 gEq/mL，n=3)較正常妊娠組(8.75 gEq/mL，n=8)低，統計分析差異無統計學意義(P=0.597)；而晚期妊娠平均游離DNA(245.23 gEq/mL，n=16)較正常妊娠組(49.77 gEq/mL，n=30)明顯升高(約升高492%)，差異有統計學意義(P=0.001)；由此認為，妊娠期高血壓疾病時肝、腎功能受損，影響循環中胎兒DNA的清除。檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA可以作為潛在的篩查妊娠期高血壓疾病的指標。

5.3妊娠期糖尿病妊娠期糖尿病是指在妊娠期首次出現或發現的糖尿病，對母兒都有較大危害[5](75)。近些年發病率有增高趨勢，但病因及發病機制尚不明確，因此早期防治十分重要。2010年，湯冬玲[23]用血漿DNA抽提法提取62例妊娠中晚期孕婦外周血中胎兒游離DNA，通過實時熒光定量PCR法檢測兩組孕婦外周血胎兒DNA8水平；結果顯示，妊娠期糖尿病組孕婦外周血中胎兒游離DNA水平(均值212.31±80.95拷貝數/mL，n=32)明顯高于正常孕婦組(均值152.08±62.61拷貝數/mL，n=32)，差異有統計學意義(P<0.01)；并且認為，胎兒游離DNA水平的變化可作為輔助診斷及預防妊娠期糖尿病的一項有效指標。而2013年，Zamanpoor等[22]提出了不同的結論，其運用實時定量PCR技術檢測孕婦外周血漿中Y染色體上的SRY基因水平，進行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)的基因水平定量檢測對比，發現妊娠期糖尿病組中期妊娠平均游離DNA水平(6.09 gEq/mL，n=8)較正常妊娠組(8.75 gEq/mL，n=8)低，晚期妊娠平均游離DNA水平(42.43 gEq/mL，n=32)較正常妊娠組(49.77 gEq/mL，n=30)低，統計分析差異無統計學意義(P=0.400和P=0.621)；認為胎兒游離DNA水平會隨著胎齡的增加而增加，在妊娠期糖尿病時胎盤功能改變影響母胎血液循環。兩者有著完全不同的結論，因此妊娠期糖尿病方面的臨床應用還需進行大樣本的數據研究。

6小結

孕婦外周血中胎兒游離DNA作為一種新的生物標志物，在產前診斷及妊娠相關性疾病的防治方面提供了新的思路，被用于預測臨床問題，具有諸多優勢，但目前僅部分應用于臨床實踐中。為了進一步廣泛臨床應用，還需嚴格的臨床論證以及尋找更多的方法，以更好地應用孕婦血漿中胎兒游離DNA來診斷遺傳病及妊娠相關性疾病(如稽留流產、死胎等)。近年來，分子生物學技術的快速發展，在孕婦外周血中胎兒游離DNA方面的研究將更加深入，其在產科中的臨床應用也將更廣。

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摘要：檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA，為無創產前診斷及妊娠相關性疾病的防治找到了新途徑，此種技術具有諸多優勢。孕婦外周血中胎兒游離DNA測序可用于胎兒非整倍體疾病、胎兒單基因遺傳病、胎兒血型的檢測、胎兒性連鎖疾病的產前診斷篩查；胎兒游離DNA水平的變化可作為一種新的生物指標為妊娠相關性疾病的診斷及治療提供幫助。隨著分子生物學技術的不斷發展，對孕婦外周血中胎兒游離DNA的研究將更加深入。

關鍵詞：胎兒游離DNA；孕婦血漿；產科

The Application of Fetal Cell-Free DNA in Maternal Peripheral Blood in ObstetricsCHENGLi-qin1,TIANChun-fang2.(1.MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou518041,China; 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ShenzhenSeventhPeople′sHospital，Shenzhen518081,China)

Abstract:The detection of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood has opened up a new avenue of research for noninvasive prenatal diagnosis,prevention and treatment of pregnancy-related diseases,which has many advantages. The sequencing of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood can be used as prenatal disgnosis for fetal aneuploidy diseases and fetal monogenic hereditary diseases,the detection of fetal blood type and prenatal screening and diagnosis of sex-linked disorders.The changes of fetal cell-free DNA level can be used as a new index of clinical diagnosis and treatment on pregnancy related diseases.With the development of molecular biology,the study of fetal cell-free DNA will be deeper.

Key words:Cell-free fetal DNA; Maternal plasma; Obstetrics

收稿日期：2014-06-05修回日期：2014-09-07編輯：鄭雪

中圖分類號：R711

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)05-0796-03