四物湯揮發油的藥理作用研究

楊歡，周莉江，劉婷婷，甘彥雄，彭偉，何瑤

·藥理毒理·

四物湯揮發油的藥理作用研究

楊歡，周莉江，劉婷婷，甘彥雄，彭偉，何瑤

目的：觀察四物湯中揮發油的藥理作用及其與藥效的相關性。方法：建立小鼠痛經模型、大鼠離體子宮平滑肌痙攣模型考察其對子宮的藥效作用；建立氯化乙酰膽堿誘導的小鼠胃腸痙攣模型，觀察四物湯揮發油對小鼠胃排空、腸推進的影響；建立小鼠戊巴比妥鈉睡眠模型考察其鎮靜催眠作用。結果：四物湯揮發油對小鼠痛經模型具有鎮痛作用，對離體子宮平滑肌的收縮具有抑制作用；對正常小鼠與胃腸痙攣模型小鼠的胃排空、腸推進具有抑制作用；與閾下劑量的戊巴比妥鈉對小鼠催眠具有協同作用。結論：四物湯中的揮發油主要具有與其臨床應用相關的調經止痛作用，此外還具有抑制胃腸運動、鎮靜催眠的作用。

四物湯；揮發油；痛經模型；藥理作用

湯劑是具有豐富內涵的復雜化學體系，富含揮發性成分的湯劑實為芳香水復合制劑[1]。湯劑防病治病的基礎是其所含多種化學成分的總體效應所致，其中揮發油具有多方面的生理活性。《四物湯》出自于唐朝藺道人所著《仙授理傷續斷秘方》。全方由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成，具有補血和血的功效，主治營血虛滯癥[2-4]，是婦科調經的基本方。因其運用于婦科疾病最為廣泛，故稱譽為“婦科圣方”。四物湯中的化學成分主要有苷類、有機酸類、生物堿、多糖、揮發油、有機酸酯類及氨基酸等成分，其中揮發油是有較強生理活性的成分[5-8]，主要來自當歸、川芎兩味藥材。《中國藥典》2010年版中“四物合劑”制法項下規定，當歸、川芎須先經水蒸氣蒸餾工藝提取[9]，以充分獲得及保存兩味藥

材中所含有的揮發性成分。有研究發現，50%乙醇滲漉工藝相對傳統水提方法能將四物湯中主要藥效成分較好地保留[10]。四物湯方中的揮發油類成分是四物湯的主要有效部位之一。本文通過水蒸氣蒸餾法提取四物湯中的揮發油成分對其藥理作用進行研究，并為四物湯的臨床應用及其新制劑開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

HW-400S恒溫平滑肌槽、BL-420E生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗材料

熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.干燥塊根的炮制加工品（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1311007）；當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis (Oliv.)Diels.的干燥根（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1311008）；川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖（四川浩博藥業有限公司，批號：131201）；白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1312006）。以上中藥飲片經檢驗符合《中國藥典》(2010年版)項下標準。苯甲酸雌二醇注射液（赤峰博恩藥業有限公司，批號:120901）；縮宮素注射液（山西省芮城科龍獸藥有限公司，批號：20140101）；布洛芬混懸滴劑（上海強生制藥有限公司，批號：130708027）。Locke's液(每1000 mL含NaCl 9.0 g，KCl 0.42 g，CaCl20.24 g，NaHCO30.2 g，Glucose 1.0 g）為實驗室自制。硫酸阿托品注射液（杭州錢浪藥業有限公司，批號：20100501）；氯化乙酰膽堿為分析純（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：A131230）；糊精（成都科龍化工試劑廠，批號：20110428）；活性炭為分析純（成都市科龍化工試劑廠，批號：2014062701)；戊巴比妥鈉（中國醫藥上海化學試劑公司，批號20020915）。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄兼用，6到8周齡，體重18～22 g；雌性SD大鼠，體重250～300 g，均由成都達碩生物科技有限公司（科技部實驗動物生產許可證編號：SCXK(川)2012-24）提供。

2 方法與結果

2.1 試驗樣品的制備

四物湯揮發油為實驗室自制。取當歸、川芎飲片各50 g，置于圓底燒瓶中，加900 mL水，浸泡0.5 h，加熱至沸，回流，保持微沸5 h，直到揮發油提取器中油量不再增加，停止加熱，靜置1 h，收集黃色透明油狀液體。

精密稱取四物湯揮發油，加吐溫-80置于研缽研勻，加生理鹽水高速攪拌制備O/W型乳劑，制得高、中、低劑量試驗藥液。

2.2 四物湯揮發油對小鼠痛經模型的影響

取小鼠70只，體重18～22 g。其中雌性小鼠60只，雄性小鼠10只。雄性小鼠為陰性對照組，60只雌性小鼠隨機分為6組，分別作為空白組、模型組、陽性對照組、揮發油高、中、低劑量組。每天上午給小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.01 mg．g-1(空白組除外)，連續3 d，第2天開始，每天下午按0.02 mL．g-1灌胃給藥1次，空白組、模型組給予同體積生理鹽水，連續3d。第4天灌胃給藥前各組動物禁食不禁水12 h，第4天灌胃給藥后1 h腹腔注射縮宮素0.05 U．g-1，以扭體反應為子宮強烈收縮的指標，觀察記錄小鼠在注入縮宮素后30 min內的扭體次數。實驗結果見表1。

表1 四物湯揮發油對小鼠痛經模型的影響(±s，n=10)

表1 四物湯揮發油對小鼠痛經模型的影響(±s，n=10)

注：*表示與模型組比較P＜0.05；**表示與模型組比較P＜0.01；△△表示與空白組比較P＜0.01；抑制率（%）設模型組為0%。

發生率（%）陰性對照組 / 0±0 / 0空白組 / 22.4±7.2 / 100模型組 / 31.5±5.78△△0 80陽性對照組 40 7±4.12**77.8 80低劑量組 20 8.88±3.44**71.8 80中劑量組 40 8.5±6.55**73.0 80高劑量組 80 8.6±2.61**72.7 70組別 劑量(mg．kg-1) 扭體次數 抑制率（%）

模型組與空白組比較，扭體次數增加（P＜0.01），說明造模成功。四物湯揮發油的高、中、低劑量均能明顯緩解縮宮素致小鼠子宮的激烈收縮。但四物湯揮發油高、中、低劑量組之間比較無顯著性差異，說明在達到治療劑量后，作用強弱與劑量無關。

2.3 四物湯揮發油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣模型的影響

選取體重250～300g 的未孕雌性SD大鼠50只，隨機分為4組，分別作為空白組、陽性對照組、揮發油高、中、低劑量組。正式試驗前3天，每天皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg．kg-1；第三天注射苯甲酸雌二醇1 h后，用頸椎脫臼法處死大鼠，剖腹取出子宮條（2 cm），置于盛有已預熱的Locke's液中，剝離附著于子宮的脂肪組織，陰道端結扎并固定于盛有65 mL洛氏液的小槽下端，另一端與張力換能器相連（負荷1g），恒溫水浴保持工作溫度（37±0.5℃），pH 7.3，并不斷向營養液中通入95%O2和5%CO2的混合氣體（每分鐘60～80個氣泡），但不得影響子宮平滑肌的舒縮活動，用BL-310生物機能實驗系統記錄運動曲線（儀器參數為：麥氏浴槽：紙速2.5 mm．min-1，靈敏度0.2 mV．cm-1，時間常數DC，濾波10 Hz）。

待子宮肌條活動穩定，自發節律恢復后，記錄一段正常子宮收縮曲線后，加入縮宮素，使終濃度為10 U．L-1，加入縮宮素后子宮立即呈強直性收縮，前5 min內平均收縮張力變化較大，但在5～30 min內變化較為恒定，為周期性收縮。因此實驗在加入縮宮素15 min后滴加高、中、低三種劑量的四物湯揮發油藥液、陽性對照藥液5mL。觀察給藥前10 min及給藥后10 min子宮收縮張力的變化（空白組給予生理鹽水），觀察子宮舒縮曲線，計算抑制率（%）=［（給藥前曲線下面積-給藥后曲線下面積）/給藥前曲線下面積］×100%。實驗結果如表2所示。

表2 四物湯揮發油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣的抑制作用(±s,n=10)

表2 四物湯揮發油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣的抑制作用(±s,n=10)

注：*表示與空白組比較P＜0.05；**表示與空白組比較P＜0.01

組別 劑量（mg） 抑制率（%）空白組 / 22.75±9.47陽性對照組 10 63.42±4.32**揮發油高劑量組 20 65.05±9.05**揮發油中劑量組 10 65.95±7.43**揮發油低劑量組 5 64.38±8.57**

四物湯揮發油藥液高、中、低劑量組均能顯著減輕縮宮素致大鼠離體子宮痙攣性疼痛（P＜0.01），但作用強弱與劑量無明顯相關。

2.4 四物湯揮發油對正常小鼠胃排空和腸推進的影響

取50只小鼠按體重質量隨機分為5組，每組10只，分為空白組、陽性對照組、四物湯組、揮發油高、中、低劑量組。四物湯揮發油高、中、低劑量組分別給予四物湯揮發油高、中、低劑量乳劑灌胃0.02mL．g-1，陽性對照組灌胃硫酸阿托品0.3 mg．kg-1給藥劑量，空白組灌胃同體積生理鹽水，連續3天。末次給藥前禁食16小時，禁食期間自由飲水。末次給藥30分鐘后灌胃0.8 mL炭末糊（糊精100 g，蒸餾水130 mL，活性炭粉末10 g，混合均勻后配制成總體積為200 mL的黑色半固體糊狀物，密度為1.2 g．mL-1），灌胃活性炭糊30分鐘后脫頸處死小鼠，開腹取出全腸胃，清除胃表面的血漬，稱重（胃總重），沿大彎側剪開胃，洗去胃內殘留物，濾紙吸干水分，再稱重（胃凈重）；兩次重量之差為胃內殘留物重量，與灌胃炭末糊總重量做差值計算胃排空量，胃排空量與炭末糊總重量做比值，計算胃排空率。測量小腸全長與炭末前端至幽門的距離，以二者之比作為小腸的推進率。試驗結果見表3。

表3 四物湯揮發油對正常大鼠胃排空腸推進的影響(±s,n=10)

表3 四物湯揮發油對正常大鼠胃排空腸推進的影響(±s,n=10)

*表示與空白組比較 p＜0.05 **表示與空白組比較 p＜0.01

組別揮發油劑量（mg．kg-1） 胃排空率 腸推進率空白組 / 58.1±11.4 54.7±15.8陽性對照組(阿托品) / 33.7±7.1** 35.4±4.9**高劑量組 400 40.5±12.9** 39.2±6.8*中劑量組 200 43.4±6.6* 43.4±5.1*低劑量組 100 48.7±13.8 41.4±11.9*

由表3可知，與空白組比較，四物湯的揮發油高、中劑量組及陽性對照組小鼠胃排空運動減弱，四物湯揮發油低劑量組小鼠胃排空有減弱的趨勢，但無統計學意義（p＞0.05）；與空白對照組比較，四物湯的揮發油高、中、低劑量組及陽性對照組小鼠腸推進減慢。

2.5 四物湯揮發油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進影響

將60只小鼠按體重質量隨機分為6組，每組10只，分為空白組、模型對照組、陽性對照組、揮發油高、中、低劑量組。空白組和模型對照組予等容量生理鹽水灌胃，揮發油高、中、低劑量組，陽性對照組及炭末糊的給藥方法同“2.4”，除空白組外，各組小鼠灌胃活性炭糊后立即腹腔注射氯化乙酰膽堿0.5 mg．kg-1，30分鐘后脫頸處死小鼠，檢測指標及檢測方法同“2.4”。試驗結果見表4。

由表4可知，模型組和空白組比較，模型組的胃排空率和腸推進率增加，說明造模成功。與模型組比較，四物湯揮發油高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠胃排空減弱同時腸推進減慢。

表4 四物湯揮發油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進的影響(±s,n=10)

表4 四物湯揮發油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進的影響(±s,n=10)

*表示與模型組比較 p＜0.05 **表示與模型組比較 p＜0.01

組別劑量（mg．kg-1）胃排空率 腸推進率空白組 / 58±11.4 54.7±15.8模型組 / 82.3±3.3 73.5±5.5陽性對照組(阿托品) 10 36.7±4.9**39.7±7.2**揮發油高劑量組 400 49.3±8.7**46.9±6.9**揮發油中劑量組 200 58.1±12.5**50.5±18.3**揮發油低劑量組 100 73.0±11.8*56.1±14.2**

2.6 四物湯揮發油對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間影響

將50只小鼠按體重質量隨機分為4組，每組10只，分為空白組、揮發油高、中、低劑量組。揮發油高、中、低劑量組每日給小鼠灌胃揮發油乳劑0.02 mL．g-1，四物湯組按四物湯成人每日給藥劑量折算為小鼠給藥劑量12 g．kg-1給藥，空白組灌胃同體積生理鹽水。連續給藥3 d，第三日給藥前禁食不禁水20 h，給藥后30 min腹腔注射閾下劑量25 mg．kg-1戊巴比妥鈉。觀察各組實驗動物的入睡率，以翻正反射消失1 min以上為入睡，從翻正反射消失至恢復翻正反射時間為睡眠持續時間，記錄每只小鼠睡眠時間。

表5 四物湯揮發油對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間影響

試驗結果見表5，由表5可知，與空白組比較，揮發油高劑量組入睡時間縮短，揮發油中、低劑量組的入睡時間有縮短的趨勢，但無統計學意義（p＞0.05）。與空白組比較，揮發油高、中、低劑量組的睡眠持續時間延長。

3 討論

中醫學認為“不通則痛”，痛經的根本病理機制是“氣血不通”，寒、濕、熱阻滯致氣血運行不通；氣血虛弱，不能榮養經脈致氣血運行不通。動物痛經病理模型的制備以己烯雌酚或苯甲酸雌二醇增敏、縮宮素或前列腺素致痛較為常見，該模型易操作、穩定可靠，且藥物作用后扭體次數有較好的負相關性。離體子宮平滑肌痙攣模型，具有時間短，易于操作等優點，實驗現象明顯，并且最大限度地減少了神經和體液對子宮收縮的影響，實驗結果準確度高。本試驗結果表明，四物湯中的揮發油對小鼠痛經模型具有鎮痛作用，對離體子宮平滑肌的收縮具有抑制效應。從整體動物模型和離體動物模型兩方面對四物湯中揮發油的鎮痛作用進行了評價，證明了四物湯揮發油與四物湯的功效具有較大相關性。

現代醫學認為，生理狀態下，胃腸道平滑肌的運動受自主神經壁內神經叢的支配，也與胃腸道激素、局部體液因素如組胺、前列腺素等有關[11]。通過胃排空和腸推進試驗研究發現，四物湯揮發油能延緩正常實驗動物胃排空、腸推進，也能明顯解除胃腸道興奮劑氯化乙酰膽堿誘發的小鼠胃腸平滑肌痙攣，具有抑制胃腸運動的作用；推測四物湯揮發油作用胃腸平滑肌的機制可能與其對抗膽堿能神經對胃腸道運動支配有關，其作用機理有待進一步研究。

四物湯揮發油對小鼠睡眠時間影響試驗研究結果表明：四物湯揮發油與閾下劑量的戊巴比妥鈉對小鼠催眠具有協同作用，使戊巴比妥鈉引起的小鼠睡眠時間延長，對小鼠具有鎮靜催眠的作用。

四物湯揮發油是四物湯主要有效部位之一，四物湯現代制劑中保留揮發性成分是科學正確的，其不僅具有與四物湯功效主治相關的藥理作用，同時還具有四物湯傳統功效以外的藥理作用，本研究為四物湯的臨床應用及四物湯現代制劑研發提供了參考和依據。

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（責任編輯：蔣淼）

Pharmacological effect research of the volatile oil in Siwu Decoction/

YANG Huan, GAN Yan-xiong, PENG Wei, ZHOU Li-jiang, Liu Ting-ting, HE Yao/ / (Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; Key laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province—Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To observe the pharmacological effect of volatile oil in Siwu Decoction, and research the pharmacology effect relation between volatile oil and Siwu Decoction.Method:Mice dysmenorrhea model and rat in vitro uterine smooth muscle model were used to investigate the pharmaceutical effect. Gastrointestinal spasm mice model was established using acetylcholine chloride. The gastric emptying and intestinal propulsive motility in normal mice and gastrointestinal spasm mice were observed. Sedative and hypnotic effects were investigated in pentobarbital sodium hypnosis mice.Result:Volatile oil in Siwu Decoction eased pain in mice model and inhibited uterine smooth muscle convulsion. Volatile oil also inhibited gastric emptying and intestinal propulsion in normal mice and gastrointestinal spasm mice. Volatile oil showed synergistic effect with pentobarbital sodium of under threshold dose, and signifcantly prolonged the sleeping time of mice.Conclusion:The volatile oil in Siwu decoction has the menstruation regulating and pain relieving effects which are correlated to the pharmacology effect of Siwu decoction. In addition, volatile oil can inhibit gastrointestinal motility and show sedative and hypnotic effects .

Siwu Decoction; volatile oil; dysmenorrhea model; pharmacological effect

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-016-04

1.國家自然科學基金委青年基金-基于"組分-藥效-靶點"作用網絡研究四物湯制備工藝環節評價模式（項目編號：81303238）；2.四川省科技支撐計劃項目-中藥質量控制及產品開發關鍵技術研究（編號：2014SZ0071)子課題：以四物合劑為模型的中藥口服液生產過程“譜效”質量控制模式示范性研究

成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

楊歡，男，藥劑學碩士，主要研究方向：中藥新技術、新工藝、新制劑研究

Tel:13880608823 Email:yhwrhyl@vip.qq.com。

何瑤，講師，主要研究方向：從事中藥新制劑、新劑型和新技術研究

Tel:13882280308 Email:20660306@qq.com

2014-09-12