水通道蛋白分子成像研究

林艷紅，孫夕林，程雁，吳泳儀，申寶忠

水孔通道蛋白（aquaporin，AQPs）又稱水通道蛋白，是一組高度保守的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以四聚體的形式富集于細(xì)胞膜，對(duì)水具有高度選擇通透性。水通道蛋白由Peter Agre在1993年首先發(fā)現(xiàn)，其功能的發(fā)現(xiàn)徹底改變了傳統(tǒng)的關(guān)于水分子在細(xì)胞膜上自由擴(kuò)散的理念[1，2]。目前，哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)13種高度同源的水通道蛋白亞型（AQP0-AQP12），其中，水甘油通道蛋白（AQP3，7，9，10）除可以轉(zhuǎn)運(yùn)水分子外也可轉(zhuǎn)運(yùn)某些小的中性溶質(zhì)分子如甘油、尿素等。研究證實(shí)水通道蛋白廣泛分于全身各組織器官，介導(dǎo)著不同類型細(xì)胞膜上水和小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)維持體內(nèi)滲透壓及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡具有十分重要的生理意義。近年來，隨著對(duì)AQPs研究的不斷深入，在某些病理情況下，如心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腫瘤的血管生成和細(xì)胞遷移等，AQPs分布和表達(dá)也發(fā)生了改變[3]。因此，水通道蛋白已經(jīng)成為許多疾病重要的治療靶點(diǎn)，對(duì)其功能的調(diào)控具有十分重要的治療意義。目前，亟需研發(fā)一種在體、實(shí)時(shí)、定量的AQPs檢測方法，快速準(zhǔn)確的檢測出活體組織細(xì)胞中AQPs的表達(dá)及分布。分子成像可在活體狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和分子水平生物學(xué)過程的可視化，并可進(jìn)行定性和定量分析，將復(fù)雜的生物過程轉(zhuǎn)換成直觀圖像，實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵分子靶點(diǎn)的在體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像，有助于推動(dòng)AQPs基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

分子影像學(xué)在AQPs檢測中的應(yīng)用

近年來，隨著分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，疾病的研究進(jìn)入到分子時(shí)代，分子影像學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。分子影像學(xué)是指在活體狀態(tài)下，在細(xì)胞和分子水平上應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)過程進(jìn)行成像，進(jìn)而開展定性和定量研究的一門學(xué)科，具有無創(chuàng)、活體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[4]。研究表明分子影像已成功實(shí)現(xiàn)EGFR、VEGFR、HIF-1α、OSP-1等腫瘤關(guān)鍵分子靶點(diǎn)的在體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可視化及精確定量分析[5-8]。目前，主要分子成像方法包括MRI分子成像、光學(xué)分子成像、超聲分子成像以及核醫(yī)學(xué)等成像方法。其中，MRI、PET成像技術(shù)對(duì)于AQPs成像具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1.MRI-DWI在AQPs分子成像中應(yīng)用

擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion-weighted imaging，DWI）通過檢測人體組織中水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限的方向和程度，間接反映組織微觀結(jié)構(gòu)的變化，是從細(xì)胞及分子水平研究疾病病理生理狀態(tài)的一種技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于臨床。

傳統(tǒng)DWI成像原理：布朗運(yùn)動(dòng)即組織中水分子的不規(guī)則隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，是DWI的成像基礎(chǔ)。純水中的水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)充分自由，而在活體組織中，生物膜及液體中的大分子將限制水分子的自由運(yùn)動(dòng)，當(dāng)水分子所處組織結(jié)構(gòu)和分子環(huán)境不同時(shí)，水分子擴(kuò)散程度及信號(hào)衰減也不同，DWI則通過檢測組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散狀態(tài)來反映組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)以及發(fā)現(xiàn)病變[9]。

一般來說，DWI對(duì)組織及細(xì)胞內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的敏感程度用b值表示，b值為擴(kuò)散敏感度，其反映施加的梯度脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，b值越高，對(duì)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)越敏感，組織信號(hào)衰減越明顯。常規(guī)的擴(kuò)散加權(quán)成像假設(shè)人體組織是單一均勻物質(zhì)，水分子隨機(jī)運(yùn)動(dòng)造成的組織擴(kuò)散加權(quán)信號(hào)的衰減程度隨著b值的增加呈單指數(shù)衰減。然而，活體組織中水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)既有細(xì)胞內(nèi)、外和跨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，同時(shí)也存微循環(huán)（灌注），在毛細(xì)血管中，水分子除了做布朗運(yùn)動(dòng)外，還隨著血液流動(dòng)，其內(nèi)的水分子運(yùn)動(dòng)與毛細(xì)血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)及血流速度密切相關(guān)。因此，在實(shí)際情況下單指數(shù)模型的假設(shè)無法反映真實(shí)的組織成分和結(jié)構(gòu)變化。隨著生物組織擴(kuò)散研究的不斷優(yōu)化，Le Bihan等[10]在1986年首次提出了基于IVIM雙指數(shù)模型。該模型同時(shí)考慮到體素內(nèi)存在的分子擴(kuò)散和血液微循環(huán)，認(rèn)為組織擴(kuò)散由兩部分組成，即快速擴(kuò)散質(zhì)子池（細(xì)胞外擴(kuò)散、血管內(nèi)水分子、灌注）和慢速擴(kuò)散質(zhì)子池（細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散、血管外水分子），通過采集多個(gè)b值將水分子擴(kuò)散與血液灌注分離，相對(duì)單指數(shù)模型而言可更好地反映生物組織DWI信息。

AQPs的發(fā)現(xiàn)——傳統(tǒng)水單純擴(kuò)散理念的更新：傳統(tǒng)的擴(kuò)散加權(quán)成像無論是單指數(shù)模型還是雙指數(shù)模型，均認(rèn)為水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是通過自由擴(kuò)散進(jìn)行的。直至1993年，Agre發(fā)現(xiàn)水通道蛋白，提出水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)除了自由擴(kuò)散外，還可以通過水通道蛋白進(jìn)行。而且進(jìn)一步研究也驗(yàn)證了AQP的存在并明確了水分子在組織間自由擴(kuò)散速度為（1～2）×10-3mm2／s，在AQP跨膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中擴(kuò)散速度為0.45×10-3mm2／s。由此可見，水分子在細(xì)胞膜上通過AQPs的轉(zhuǎn)運(yùn)速度明顯低于其細(xì)胞間隙自由擴(kuò)散速度。因此，鑒于水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)際運(yùn)動(dòng)情況，要利用影像技術(shù)獲得經(jīng)AQPs轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的擴(kuò)散信息，更為可靠的方法是在雙指數(shù)模型的基礎(chǔ)上，引入更多、更高b值來提高對(duì)細(xì)胞膜上由AQPs轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)極度受限水分子的檢測能力。eDWI分子成像即多b值多維度分析的增強(qiáng)版擴(kuò)散成像（enhance DWI，eDWI），在擴(kuò)散加權(quán)成像過程中通過采用連續(xù)、多個(gè)不同梯度的b值（包括低b值b＜200s／mm2、中b值300～1700s／mm2及高b值b＞1700s／mm2），獲得反映水分子在組織細(xì)胞中不同擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的分子譜。更為有趣的是水分子轉(zhuǎn)運(yùn)速率單位（mm2／s）與b值單位（s／mm2）呈倒數(shù)關(guān)系，將水分子經(jīng)由AQPs轉(zhuǎn)運(yùn)的速度值0.45×10-3mm2／s取倒數(shù)后（約為2222），恰好符合eDWI高b值范圍（＞1700）。因此，近年來研究認(rèn)為b值越高，eDWI成像檢測的對(duì)象越接近AQPs內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的水分子，而高b值條件下的eDWI就能夠利用這一原理特異性的對(duì)細(xì)胞膜上的AQPs的表達(dá)情況進(jìn)行定量評(píng)價(jià)[11，12]。

AQPs的eDWI分子成像：李佳慧等[13]采用18個(gè)（0～4500）b值，選擇水、對(duì)比劑、全血、血漿和紅細(xì)胞等不同組織，并用乙酰唑胺作為紅細(xì)胞膜水通道蛋白抑制劑進(jìn)行DWI多b值分子成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低b值（0～200）時(shí)能夠區(qū)分不同組織，具有較高的組織特異性；高b值（＞1700）時(shí)純水和血漿信號(hào)基本可以忽略，獲得的水分子擴(kuò)散的信息主要來自于經(jīng)水通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而獲得AQPs在細(xì)胞膜表達(dá)及分布信息。在此基礎(chǔ)之上，李秋菊等[14]進(jìn)行大鼠肝臟纖維化模型中AQPs的DWI多b值分子成像，研究表明與傳統(tǒng)DWI相比，高b值可以檢測早期肝臟纖維化中的變化。肝臟纖維化早期AQP1呈明顯高表達(dá)，加入抑制劑乙酰唑胺后，高b值下AQP1的表達(dá)與表觀擴(kuò)散系數(shù)呈明顯的相關(guān)性，為肝臟纖維化診斷及分期提供了新的途徑。

2.PET在AQPs分子成像中的應(yīng)用

正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET），可在分子水平上洞察人體功能代謝、基因及蛋白表達(dá)狀態(tài)，并進(jìn)行定量，是目前分子影像最主要的成像方法之一[15]。PET分子成像的關(guān)鍵是能夠特異性識(shí)別分子靶點(diǎn)的靶向分子成像探針的構(gòu)建，分子成像探針的設(shè)計(jì)通常是通過修飾和標(biāo)記靶點(diǎn)的特異性配體、抑制劑、拮抗劑、激動(dòng)劑、底物以及酶類。

放射性核素標(biāo)記AQPs特異性結(jié)合配體的分子成像：關(guān)于水通道蛋白，分子成像探針的設(shè)計(jì)構(gòu)建之一就是用放射性核素標(biāo)記的水分子以及甘油（水甘油通道蛋白），然而，由于水對(duì)于AQPs亞型并沒有特異性，使其較難廣泛應(yīng)用于PET研究。目前，研究表明通過放射性核素標(biāo)記甘油可以用來構(gòu)建水甘油通道的分子成像探針。Yuriko Saito等[16]用14C-甘油作為分子成像探針并分別在agAQPs不同表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)鼠移植瘤模型中進(jìn)行該探針的放射性分布研究。細(xì)胞水平研究表明agAQPs的表達(dá)水平與14C-甘油的攝取呈正相關(guān)，與agAQPs低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞相比，agAQPs過表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)甘油的攝取量明顯增加，加入特異性抑制劑后，甘油的攝取以劑量依賴的方式降低；與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，荷瘤鼠的在體研究結(jié)果表明不同agAQPs表達(dá)水平的腫瘤中14C-甘油的攝取并沒有顯著不同，但值得注意的是agAQPs高表達(dá)腫瘤中放射性活性與血漿相似，均以時(shí)間依賴的方式進(jìn)行衰減，而agAQPs低表達(dá)腫瘤的放射性則保持恒定。研究表明14C-甘油構(gòu)建的分子成像探針可以用來評(píng)估agAQPs的表達(dá)水平，對(duì)于特異性靶向agAQPs的分子成像有潛在應(yīng)用價(jià)值。

放射性核素標(biāo)記AQPs特異性抑制劑的分子成像：另外一種AQPs分子探針的設(shè)計(jì)方案為利用放射性核素標(biāo)記其小分子特異性抑制劑。Yukihiro等[17]利用放射性核素11C標(biāo)記AQP4的特異性抑制劑TGN-020，合成了靶向AQP4的分子成像探針[11C]TGN-020，利用該探針分別對(duì)AQP4野生型和AQP4空白鼠進(jìn)行PET成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白組小鼠相比，野生型小鼠對(duì)該探針呈明顯的整體的高攝取，與以前報(bào)道的AQP4在肌肉和骨骼肌中選擇性分布相一致；另外，兩組老鼠的心臟對(duì)[11C]TGN-020均呈明顯高攝取，這可能是由于[11C]TGN-020對(duì)AQP1也有一定的親和力，文獻(xiàn)報(bào)道AQP1與AQP4有大約60%的同源性（圖1）。同時(shí)，該研究小組對(duì)[11C]TGN-020在腦組織中的攝取情況進(jìn)行了離體驗(yàn)證，將小鼠殺死后取腦組織再次進(jìn)行PET成像，WT組小鼠的腦組織對(duì)[11C]TGN-020有明顯的高攝取，KO組小鼠的腦組織呈較低攝取（圖2）。

隨后，該研究小組首次進(jìn)行了[11C]TGN-020在健康人體的PET成像研究[18]，圖像后處理后得到顯示顱內(nèi)放射性配體分布的圖像，圖像顯示在軟腦膜及血管周圍的星形膠質(zhì)終足細(xì)胞以及脈絡(luò)叢部位有明顯的[11C]TGN-020濃聚，這與已經(jīng)報(bào)道的AQP4在顱內(nèi)的分布一致（圖3）。

以上研究結(jié)果表明，[11C]TGN-020可以特異性的與AQP4靶向結(jié)合，是放射性標(biāo)記AQPs特異性抑制劑的首次應(yīng)用，為AQPs的在體分子成像研究奠定了基礎(chǔ)。雖然TGN-020對(duì)AQP1一定的親和力，但考慮到AQP4在腦部的分布特異性，其仍可以作為AQP4PET成像的特異性探針，提供AQP4表達(dá)及分布的定量數(shù)據(jù)，并對(duì)某些與AQP4相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行分析。

AQPs分子成像面臨的挑戰(zhàn)與展望

在AQPs離體研究的基礎(chǔ)上，利用分子影像技術(shù)可在體揭示AQPs在疾病發(fā)生過程中的表達(dá)與分布變化并進(jìn)行定量分析，同時(shí)，由于AQPs特殊的結(jié)構(gòu)與功能作用方式，使AQPs的分子成像希望與挑戰(zhàn)并存。

1.eDWI開啟AQPs分子成像全新途徑及面臨的挑戰(zhàn)

圖1 [11 C]TGN-020鼠在體PET成像。a）AQP4WT鼠；b）AQP4KO鼠[17]。

圖2 [11 C]TGN-020離體鼠腦組織的PET成像。a）WT鼠；b）KO鼠[17]。

圖3 [11 C]TGN-020健康人腦組織在體PET成像[18]。

研究表明eDWI多b值擴(kuò)散加權(quán)成像可以在體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的進(jìn)行AQPs分子成像，有利于推動(dòng)AQPs基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，開啟了AQPs分子成像的全新途徑，具有廣闊的發(fā)展前景。但目前關(guān)于AQPs eDWI分子成像研究仍相對(duì)較少，且多處于離體水平，需要進(jìn)一步開展更多的在體及相關(guān)臨床應(yīng)用研究；同時(shí)，要實(shí)現(xiàn)AQPs的精確定量仍存在一些挑戰(zhàn)，如隨著b值的增高，DWI圖像信噪比降低、易發(fā)生變形和失真，同時(shí)，由于連續(xù)多b值掃描，獲得圖像數(shù)據(jù)量大，數(shù)據(jù)后處理復(fù)雜等[12]。針對(duì)以上挑戰(zhàn)，可從以下幾個(gè)方面提高M(jìn)R設(shè)備性能及掃描技術(shù)，如增加磁場的均勻性、空間線性和保真度，配置更高密度的靶線圈及增大掃描視野等，此外，高性能的專用圖像后處理系統(tǒng)及質(zhì)量控制軟件也是實(shí)現(xiàn)AQPs精確定量分析的重要基礎(chǔ)工具。

2.靶向分子成像探針的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)AQPs分子成像的關(guān)鍵

AQPs特異性抑制劑的研發(fā)是構(gòu)建高親和性、高靶向性分子成像探針的重要前提，由于小分子特異性抑制劑篩選方法的不足以及AQPs亞型之間的高度同源性，AQPs特異性抑制劑仍處于研究階段。目前，AQPs的抑制劑主要包括離子類抑制劑、小分子有機(jī)化合物類抑制劑以及多肽類抑制劑。離子類抑制劑[19-21]，如Hg＋、Ag＋、Au3＋等金屬離子以及四乙胺等非金屬離子，可與胞外段特定的結(jié)構(gòu)域相互作用，形成空間位阻，封閉水孔通道。但該類抑制劑的亞型特異性較小且具有一定的毒性，一定程度上限制其臨床應(yīng)用。近年來，乙酰唑胺、布美他尼及其衍生物（AqB013）、TGN-020（2-甲酰氨基-1，3，4-噻二唑）等小分子類抑制劑的研究越來越受到研究者的重視，是目前研究較為廣泛的一類AQPs抑制劑。研究表明乙酰唑胺[22，23]是最早提出來的AQPs抑制劑，盡管對(duì)其抑制作用仍存在爭議，但目前研究學(xué)者認(rèn)為其主要抑制AQP1的活性，且已有研究進(jìn)行了11C標(biāo)記甲基乙酰唑胺的初步合成。TGN-020[17，18，24]在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中均可以明顯抑制AQP4的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并成功進(jìn)行了放射性標(biāo)記其類似物的PET成像。布美他尼及其衍生物（AqB013）等[25]袢利尿劑具有AQP1和AQP4抑制活性，其中，AqB013對(duì)AQPs的抑制作用更加明顯，有望成為AQPs選擇性抑制劑化學(xué)合成基礎(chǔ)。多肽類抑制劑被認(rèn)為是特異性最高的一類抑制劑[26，27]。研究發(fā)現(xiàn)單克隆抗體aquaporumab可以與AQP4-IgG自身抗體競爭特異性結(jié)合AQP4，抑制AQP4介導(dǎo)的水分子轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著AQPs抑制劑作用機(jī)制及AQPs分子結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，以高親和性、高靶向性抑制劑為前體構(gòu)建的分子成像探針有望實(shí)現(xiàn)AQPs的分子成像。

3.多模態(tài)成像體系引領(lǐng)AQPs分子成像未來發(fā)展趨勢

近年來，隨著分子影像技術(shù)的迅速發(fā)展，研究者們嘗試將PET與常規(guī)的影像學(xué)技術(shù)相結(jié)合，如PET／CT、PET／MR，逐步形成了多模態(tài)成像體系，一次成像可同時(shí)得到感興趣區(qū)生理功能信息及解剖結(jié)構(gòu)信息是分子影像學(xué)近年來最大的進(jìn)步，同時(shí)也代表了分子影像學(xué)的發(fā)展方向。目前，PET／CT已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得較大的臨床效果；與此同時(shí)，PET／MR也逐步完成向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化[28]。與PET／CT相比，PET／MR避免了CT帶來的放射性損傷，并提高了軟組織分辨率。值得注意的是，PET／MR可實(shí)現(xiàn)PET提供的定量信息與MR特有的功能性磁共振成像（fMRI）序列，如eDWI、DCE和MRS等特定功能序列同步采集，即一次掃描可同時(shí)獲得反應(yīng)組織代謝的PET信息和反應(yīng)組織解剖結(jié)構(gòu)與功能的MR信息，保證了感興趣區(qū)時(shí)間和空間位移上的一致性，將兩種信息同步融合后分析，可進(jìn)行精確定量，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的優(yōu)勢互補(bǔ)。研究表明利用PET／MR同步采集特性，可進(jìn)行一定腦功能的實(shí)時(shí)監(jiān)測研究[29]。針對(duì)AQPs水分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的實(shí)時(shí)性與動(dòng)態(tài)性，通過PET／MR可實(shí)現(xiàn)其在體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、精確定量成像，在多角度、多維度及多層次精細(xì)反映AQPs分布及表達(dá)狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了APQs真正意義上的結(jié)構(gòu)、功能與分子一體化成像，為AQPs的分子成像開辟了一條全新的途徑，同時(shí)，多模態(tài)分子成像體系也是未來AQPs分子影像研究的發(fā)展趨勢。

綜上所述，AQPs是許多疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，分子影像學(xué)是多學(xué)科交叉領(lǐng)域。隨著AQPs特異性抑制劑以及影像設(shè)備的不斷發(fā)展，分子成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)AQPs表達(dá)水平及分布狀態(tài)在體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)成像，為臨床篩選分子靶向治療優(yōu)勢人群、療效檢測提供可靠依據(jù)，使AQPs分子成像的臨床轉(zhuǎn)化成為可能。

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