天麻素調節癲疒間大鼠海馬炎癥信號通路的抗癲疒間機制研究

李 飛，孫亞凌，成祥林，蔡光欣，蔡新宇，徐曉明，朱占勝

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天麻素調節癲疒間大鼠海馬炎癥信號通路的抗癲疒間機制研究

李 飛，孫亞凌，成祥林*，蔡光欣，蔡新宇，徐曉明，朱占勝

目的 探討天麻素調節戊四氮(PTZ)致癲疒間大鼠海馬炎癥信號通路的抗癲疒間機制。方法將40只成年Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC)、癲疒間模型組(PTZ)、天麻素大劑量組(Gh)和天麻素小劑量組(Gs)，觀察四組大鼠的行為學和腦電圖的變化，應用Western blot檢測p38MAPK蛋白表達，ELISA方法測定大鼠海馬IL-1β、IL-2、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。結果與PTZ組相比，Gh組大鼠癲疒間發作程度、腦電圖改變、海馬p38MAPK蛋白的表達和部分炎性細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量明顯減少(P<0.01)。結論天麻素可通過降低癲疒間大鼠海馬p38MAPK蛋白的表達、抑制部分炎性細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌，從而影響炎癥信號通路，以達到對抗癲疒間的效果。

癲疒間；戊四氮；天麻素；p38MAPK蛋白；細胞因子

0 引言

全球約有3 000萬癲疒間患者，我國約有650萬，每年新增100萬左右[1]，癲疒間目前的治療仍以藥物治療為主，且主要為西藥，長期服用難以堅持，患者依從性較差，因此，必須尋找有效、低毒的治療藥物。天麻為傳統中藥，長期作為治療癲疒間的主要藥物之一，其有效成分天麻素具有抗炎、抗氧化作用[2]，筆者臨床應用和前期動物實驗均發現天麻素有拮抗癲疒間的作用，但是其具體機制需要進一步闡明。本研究旨在通過觀察兩種濃度的天麻素對戊四氮(PTZ)致癲疒間大鼠行為學、腦電圖、p38MAPK蛋白表達及部分細胞因子如IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的影響，探討天麻素調節癲疒間大鼠海馬炎癥信號通路的抗癲疒間機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 戊四氮及多聚甲醛均為Sigma公司產品，ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，p38MAPK抗體由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，天麻素(C13H18O7)由江蘇寶澤堂醫藥科技有限公司提供(批號:20100801,純度:99.2%)。

1.2 動物

1.2.1 分組與處理 清潔級健康雄性Wistar大鼠(長江大學醫學院動物中心提供)40只，體重280～340 g。隨機分為正常對照組(NC組)、PTZ組(戊四氮)、Gh組(天麻素大劑量)、Gs組(天麻素小劑量)，每組10只。正常分籠飼養于正常晝夜環境中，正常進食水。實驗室安靜、通風、空氣清潔，溫度為21～23 ℃，濕度為42%～45%。

1.2.2 動物模型制備 NC組腹腔內給予0.9%(質量分數)生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，周期第8、9、10天時，腹腔注射0.9%(質量分數)生理鹽水45 mL/kg，1次/d；PTZ組腹腔內給予0.9%(質量分數)生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，第8、9、10天時，每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg[3]；Gh組腹腔內給予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期為10 d。第8、9、10天時，每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg；Gs組腹腔內給予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期為10 d。第8、9、10天時每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg。四組于實驗周期第10天終止，完成注射后均觀察2 h，并記錄腦電圖。

1.2.3 腦電圖記錄 清醒狀態下將大鼠固定，采用頭皮針電極，雙極導聯法(額-頂)連接。電極分別取兩眼連線中點(額葉)及兩耳連線中點(頂葉)插入固定,鼻根部接地線。

1.2.4 行為學觀察 參照Racine癲疒間發作行為標準[4]進行觀察記錄：Ⅰ級：面肌抽動；Ⅱ級：節律性動頭；Ⅲ級：前肢抽搐；Ⅳ級：軀干及前肢陣攣；Ⅴ級：四肢抽搐、全身陣攣。

1.2.5 標本采集與處理 觀察1 h后，四組大鼠均行心臟灌注固定、斷頭取腦，依文獻[4]確定腦及海馬的部位與形態，制備海馬組織勻漿。

1.2.6 指標測定 Western blot檢測p38MAPK表達。ELISA試劑盒：嚴格按照說明書進行操作，測定標本中大鼠海馬組織IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.7 統計學分析 數據以表示，組間比較應用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 行為變化 PTZ組大鼠給藥后，平均56 s左右出現眨眼、動須、節奏性咀嚼、節律性點頭、肢體抽搐等表現，其中7只出現Ⅴ級發作，2只出現Ⅳ級發作，1只出現Ⅲ級發作。Gh組大鼠給藥以后平均12 min左右出現眨眼、動須、節奏性咀嚼、節律性點頭、肢體抽搐等表現，其中1只出現Ⅳ級發作，1只出現Ⅲ級發作，6只出現Ⅱ級發作，2只出現Ⅰ級發作。NC組給藥前后均無明顯變化。PTZ組與Gh、Gs組比較，PTZ組與NC組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 四組大鼠行為學改變比較

2.2 腦電圖變化 NC組大鼠腦電圖表現為α波或β波，PTZ組10只大鼠均出現陣發性疒間性放電，表現為高電位的棘波、尖波、棘-慢復合波、尖-慢復合波，Gh、Gs組部分大鼠有尖波、棘-慢復合波、尖-慢復合波出現，PTZ組與NC組比較，Gh、Gs組與PTZ組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，Gh組與Gs組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組大鼠腦電圖改變比較

2.3 p38MAPK蛋白和TNF-α檢測結果 Gh、Gs、NC組大鼠海馬組織p38MAPK蛋白和TNF-α的表達均低于PTZ組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 四組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達和TNF-α測定

2.4 ELISA檢測結果 PTZ組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-2、IL-6含量高于Gh、Gs、NC組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 四組大鼠海馬部分白介素指標測定(mg/L)

3 討論

癲疒間發病機制復雜，炎癥機制在癲疒間的發病中占有重要的地位，許多神經遞質和細胞因子在其中發揮重要作用，而天麻素具有抗炎作用，并且對癲疒間具有治療作用。有研究表明，p38MAPK通路在炎癥反應的上游起調控作用，可以磷酸化ATF2N端活化區域69、7l位的蘇氨酸，導致其轉錄活性升高，與靶基因順式元件結合增強，從而調節包括IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎性細胞因子在內的基因表達[5]。同樣，本研究結果顯示，PTZ誘導的癲疒間大鼠p38MAPK蛋白表達增高，信號轉導通路被激活而Gh、Gs組p38MAPK表達減少，且隨著天麻素劑量增加，p38MAPK表達逐漸減少，呈現劑量依賴性保護效應，提示p38MAPK通路參與PTZ誘導的癲疒間大鼠發作后的炎癥病理過程，天麻素可抑制其表達。

許多細胞因子參與了癲疒間的發病過程，其在癲疒間發病中起促進和抑制作用，而促進癲疒間發展的細胞因子主要有IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α，其促進癲疒間發展的機制可能為：①抑制神經膠質細胞內谷氨酰合成酶的活性；②興奮性氨基酸活性的增強；③刺激神經膠質細胞增生；④誘導神經膠質細胞產生其他細胞因子；⑤提高海馬錐體細胞的興奮性；⑥減弱抑制性突觸后電位，從而導致異常放電[6-7]。IL-2在中樞神經中具有促進神經及膠質細胞生長的作用，同時調節和影響神經遞質的傳遞及激素的釋放分泌[8]。本研究結果顯示，PTZ組IL-lβ含量顯著高于NC組(P<0.01)，PTZ組IL-1β的異常升高為自身所致，繼而異常升高的其他細胞因子又參與了癲疒間的病理過程。另外，PTZ組IL-2、IL-6表達高于Gh、Gs、NC組(P<0.01)；Gh、Gs組IL-2、IL-6表達高于NC組(P<0.01)，但低于PTZ組；Gh組和Gs組比較不同濃度的天麻素對IL-1β、IL-2、IL-6的表達，高濃度的天麻素可減少其表達(P<0.05)。提示PTZ組中細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6參與了疾病的發病過程，與癲疒間疾病具有相關性；而與模型對照組比較，Gh組IL-1β、IL-2、IL-6值明顯降低，提示天麻素具有抗炎作用，可有效減輕炎癥反應，保護腦組織，減輕腦損害。Gh組中PTZ致疒間大鼠腦電圖波幅及頻率明顯降低，也較好地佐證了上述結論。同時，PTZ組TNF-α高于Gh、Gs、NC組(P<0.01)；Gh、Gs組TNF-α表達高于NC組(P<0.01)，但低于PTZ組(P<0.01)；Gh組和Gs組比較，不同濃度的天麻素對TNF-α的表達有影響，高濃度的天麻素可減少TNF-α的表達(P<0.05)。由此推斷，天麻素有抑制癲疒間發作的作用，其機制可通過降低海馬的TNF-α活性和表達，抑制癲疒間的產生和發展來發揮抗癲疒間的作用。筆者前期研究發現，TNF-α可以通過增加NMDA及其受體的表達，抑制GABA及其受體的表達，從而發揮抗癲疒間的作用。另外，由于p38MAPK通路在炎癥反應的上游起著調控作用。其對IL-1β、IL-2、IL-6的表達會產生影響。有報道，在腦組織中，TNF-α可以促進細胞因子的釋放，影響癲疒間的發生發展[9]。故本實驗中Gh、Gs組中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達減少。

綜上所述，天麻素對癲疒間的抑制作用，主要通過p38MAPK蛋白表達減少促使下游產物降低和其本身的抗炎作用對IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達的抑制，使IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達減少，從而達到抑制癲疒間的效果。但天麻素減少p38MAPK蛋白和部分炎性細胞因子的表達的具體機制還有待于進一步探討。

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Research on antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of epileptic rats

LI Fei,SUN Ya-ling,CHENG Xiang-lin*,CAI Guang-xin,CAI Xin-yu,XU Xiao-ming,ZHU Zhan-sheng

(The Yangtze University Clinical Medical College,The First People’s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

Objective To investigate the antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats.Methods40 adult Wistar rats were randomly divided into normal control group (NC),epileptic model group (PTZ),gastrodin high-dose group (Gh) and gastrodin small doses (Gs) group.The changes of behavior and EEG were observed.p38MAPK protein expression was detected by Western blot,the content of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in rat hippocampus were detected by ELISA method.ResultsThe levels of seizure degree,EEG changes,p38MAPK protein expression and some inflammatory cytokines IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in hippocampus of Gh group rats were significantly lower than those of PTZ groups (P<0.01).ConclusionGastrodin can reduce p38MAPK protein expression in hippocampus of epileptic rats,inhibit the secretion of inflammatory cytokines such as IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α,and achieve the antiepileptic effect.

Epilepsy; Pentylenetetrazole; Gastrodin; p38MAPK protein; Cytokines

2014-09-10

長江大學附屬第一醫院 荊州市第一人民醫院，荊州 434000

湖北省衛生廳科研一般項目(JX6B33)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505002

*通信作者