曲妥珠單抗對心肌細胞損害作用的實驗研究

劉衛東，葉英響*，楊潔紅

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曲妥珠單抗對心肌細胞損害作用的實驗研究

劉衛東1，葉英響1*，楊潔紅2

目的 探討曲妥珠單抗對大鼠心功能的影響及其作用機制。方法50只6周齡SPF級SD大鼠隨機均分為觀察組和對照組。觀察組大鼠腹腔注射曲妥珠單抗，共計給藥7 d；對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，體積與注射時間同觀察組。分別于給藥前后用心臟超聲檢查大鼠心功能變化；采用TUNEL技術檢測細胞凋亡情況，同時檢測大鼠心肌細胞Caspase-3活性。結果給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。給藥1周后，觀察組凋亡指數(AI)顯著增加，Caspase-3活性顯著增強，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論曲妥珠單抗會導致心肌細胞損害，其機制可能與激活Caspase-3、促進心肌細胞凋亡有關。

曲妥珠單克隆抗體；心功能；凋亡

0 引言

曲妥珠單抗(赫賽汀)是抗人體表皮生長因子受體-2(Her-2)的單克隆抗體，其通過附著在Her-2上阻止人體表皮生長因子在Her-2上的附著，從而阻斷癌細胞的生長。1998年FDA批準曲妥珠單抗用于Her-2過度表達的乳腺癌治療，極大程度降低了乳腺癌的復發率和死亡率，目前曲妥珠單抗已經成為乳腺癌治療的主要靶向治療藥物。然而在臨床應用中關于曲妥珠單抗所致心臟不良反應的報道較多，主要集中于導致患者左心室收縮功能降低。Morris等[1]報道，應用曲妥珠單抗后，患者可能出現無癥狀心力衰竭或有癥狀心力衰竭等。也有報道，單一使用曲妥珠單抗引起心力衰竭的發生率約為2.5%～4.7%[2]，但是關于其具體作用機制目前尚不清楚。本研究給予大鼠腹腔注射曲妥珠單抗，觀察其對大鼠心功能的影響，探討曲妥珠單抗所致心臟損害的可能作用機制，以期為臨床預防、治療提供參考，現總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 50只6周齡SPF級SD大鼠購自本院動物實驗中心，實驗前對動物進行稱重，大鼠體重(158.4±7.9)g。將50只大鼠按隨機數字表法分為觀察組和對照組，每組25只。兩組大鼠分籠飼養，自由飲食，控制室溫18～25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 觀察組大鼠腹腔注射曲妥珠單抗：曲妥珠單抗針(赫賽汀，440 mg/20 mL)稀釋至22 mg/mL，并于4 ℃保存；首次給藥劑量12 mg/mL，從第2天開始劑量調整為6 mg/mL，連續注射7 d，總給藥量為48 mg/mL。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，體積與注射時間同觀察組；兩組大鼠注射量按照大鼠體重每3天調整1次。同時每日觀察大鼠活動情況、飲食量、體重及皮毛色澤變化。

1.2.2 心功能檢測 分別于首次給藥前、最后1次給藥后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，并將大鼠固定于操作臺上，用彩色多普勒超聲儀進行檢測，檢測指標包括：舒張末期左心室后壁厚度(LVPWDd)、舒張末期室間隔厚度(IVSDd)、收縮期左心室后壁厚度(LVPWSd)、收縮期室間隔厚度(IVSSd)、左心室舒張末期內徑(LVEDd)、左心室收縮末期內徑(LVESd)、左心室舒張末期容量(EDV)、左心室收縮末期容量(ESV)，并計算各組大鼠左心室射血分數(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。各指標檢測5次，取平均值。

1.2.3 心肌細胞凋亡檢測 最后1次麻醉后，在冰臺上將大鼠左心室組織切取，部分用中性甲醛浸泡，剩余部分用液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中保存待檢。取左心室3個不同部位做常規石蠟切片，采用原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)對細胞凋亡進行檢測：將樣本TUNEL染色后，再于高倍鏡下對每張切片隨機選擇5個視野，記錄每個視野中總心肌細胞核數與凋亡陽性細胞核數，其中凋亡指數(AI)=凋亡陽性細胞核數/總心肌細胞核數×100%。

1.2.4 Caspase-3活性檢測 將心肌細胞裂解后，提取總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測心肌細胞組織總蛋白濃度；再按照Caspase-3活性熒光檢測試劑盒檢測Caspase-3活性；以標準誤濃度作為橫坐標、吸光度(OD值)作為縱坐標，通過繪制標準曲線計算樣品濃度，再用蛋白濃度校正即得Caspase-3活性。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 16.0統計學軟件包進行統計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，多組間數據比較采用方差分析或秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠心臟超聲檢查結果比較 兩組大鼠給藥前心功能各指標比較差異無統計學意義(P>0.05)；給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 兩組大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性檢測結果 給藥1周后，觀察組AI增加，Caspase-3活性增強，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組大鼠心臟超聲檢查結果比較

表2 兩組大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性檢測結果

3 討論

約有25%的乳腺癌患者的Her-2呈高表達。研究顯示，Her-2陽性的乳腺癌具有高侵襲性，且預后較差，臨床治療難度較高[3]。曲妥珠單抗是1998年開始由FDA批準用于抗Her-2的靶向治療藥物，該藥顯著提高了Her-2陽性乳腺癌患者的遠期生存率和生活質量。李偉等[4]單用曲妥珠單抗治療Her-2陽性中晚期乳腺癌患者，其有效率、中位無進展生存期、總生存期顯著提高。Korkaya等[5]也證實，曲妥珠單抗聯合阿霉素、紫杉醇能夠顯著提高乳腺癌患者的完全緩解率。上述研究均提示，聯合曲妥珠單抗的一線化療方案能夠顯著提高抗腫瘤的效果。但是國內外關于曲妥珠單抗用藥后誘導心功能損害的報道越來越多。Caussa等[6]發現，在采用曲妥珠單抗治療后，約有3%～9%的患者會出現不同程度的心臟不良反應。但是報道多見于臨床觀察。雖然Costantini等[7]對小鼠腹腔注射曲妥珠單抗后，發現小鼠心肌細胞出現病理性損害，但是其具體作用機制仍不清楚。因此，研究曲妥珠單抗所致心功能損害發病機制對降低藥物的不良反應有著重要意義。

黃平等[8]分別對給予曲妥珠單抗化療前后的患者進行心電圖檢查，結果顯示，化療6個月后，患者舒張期、收縮期左心室容積顯著增加，舒張末期和收縮末期左心室直徑顯著擴大，左心室射血分數和短軸縮短率也明顯降低。本研究對健康大鼠分別腹腔注射曲妥珠單抗和生理鹽水，結果顯示，給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，與給予曲妥珠單抗治療后患者的心功能表現基本相符。蒽環類抗腫瘤藥物對心肌細胞也有損害作用，可導致Ⅰ型心肌損害[9]，這種損害是不可逆的。而Russell等[10]報道，曲妥珠單抗為Ⅱ型心肌損害，往往出現于用藥3個月后，這種心肌損害均為可逆性，一旦撤藥心肌功能會重新恢復。因此。在臨床中，需要區別對待曲妥珠單抗與蒽環類抗腫瘤藥物所致的心功能異常。

本研究顯示，與對照組相比，給藥1周后，觀察組AI顯著增加，Caspase-3活性顯著增強。Chen等[11]報道，心肌細胞凋亡會引起左心室舒張功能障礙，通過抑制心肌細胞的凋亡能夠改善心室重構，表明曲妥珠單抗引起的心功能降低與心肌細胞凋亡有關。Her-2作為酪氨酸激酶參與細胞的增殖、分化[12]。Posch等[13]研究顯示，Her-2能夠維持心肌細胞功能完整性，Her-2受體激活會導致心肌細胞肥大或擴張性心肌病。推測曲妥珠單抗所致心肌細胞凋亡與抑制Her-2受體有關。韓冬等[14]證實，Her-2受體受到抑制后，會促進Bcl-xS表達，降低Bcl-xL表達，自動啟動細胞內線粒體凋亡途徑，導致細胞內線粒體功能異常，細胞正常能量代謝障礙，最終發展成心肌細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡的執行基因，多種細胞凋亡途徑最終通過激活Caspase-3而實現。因此，筆者認為，曲妥珠單抗會激活Caspase-3，進而參與Her-2受體抑制過程，最終導致心肌細胞凋亡。綜上所述，曲妥珠單抗會導致心肌細胞損害，其機制可能與激活Caspase-3、促進心肌細胞凋亡有關。但是由于曲妥珠單抗所致心臟毒性機制較為復雜，且Caspase-3介導的凋亡途徑較多，因此其具體機制仍需要進一步研究。

[1] Morris PG,Hudis CA.Anthracyclines and trastuzumab,getting to the heart of the matter:when getting to the heart is the matter[J].Breast Cancer Res Treat,2011,127(2):585-586.

[2] Bowles EJ,Wellman R,Feigelson HS,et al.Risk of heart failure in breast cancer patients after anthracycline and trastuzumabtreatment:A retrospective cohort study[J].J Natl Cancer Inst,2012,104(17):1293-1305.

[3] 劉君,楊艷芳,顧林,等.曲妥珠單抗在HER-2陽性乳腺癌患者新輔助治療中的應用研究進展[J].中國腫瘤臨床,2014，(16):1065-1068.

[4] 李偉,潘燕,李學軍,等.HER-2陽性乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗耐藥機制及新一代靶向藥物研究進展[J].中國臨床藥理學雜志,2014,30(1):48-51.

[5] Korkaya H,Kim GI,Davis A,et al.Activation of an IL6 inflammatory loop mediates trastuzumab resistance in HER-2+breast cancer by expanding the cancer stem cell population[J].Mol Cell,2012,47(4):570-584.

[6] Caussa L,Kirova YM,Gault N,et al.The acute skin and heart toxicity of a concurrent association of trastuzumab and locoregional breast radiotherapy including internal mammary chain:a single-institution study[J].Eur J Cancer,2011,47(1):65-73.

[7] Costantini DL,McLarty K,Lee H,et al.Antitumor effects and normal-tissue toxicity of 111In-nuclear localization sequence-trastuzumab in athymic mice bearing HER-positive human breast cancer xenografts[J].J Nucl Med,2010,51(7):1084-1091.

[8] 黃平,陳俊英,陳占紅,等.乳腺癌患者曲妥珠單抗治療的耐受性及心功能監測[J].腫瘤學雜志,2012,18(12):930-934.

[9] 徐欣怡,黃美蓉,湯靜燕,等.蒽環類藥物心臟毒性早期監測方法的評價[J].中國當代兒科雜志,2011,13(6):490-494.

[10]Russell SD,Blackwell KL,Lawrence J,et al.Independent adjudication of symptomatic heart failure with the use of doxorubicin and cyclophosphamide followed by trastuzumab adjuvant therapy:a combined review of cardiac data from the National Surgical Adjuvant breast and Bowel Project B-31 and the North Central Cancer Treatment Group N9831 clinical trials[J].J Clin Oncol,2010,28(21):3416-3421.

[11]Chen J,Long JB,Hurria A,et al.Incidence of heart failure or cardiomyopathy after adjuvant trastuzumab therapy for breast cancer[J].J Am Coll Cardiol,2012,60(24):2504-2512.

[12]張頻,于世英,沈鎮宙,等.中國HER-2陽性早期乳腺癌曲妥珠單抗輔助治療的初步結果[J].中華醫學雜志,2012,92(47):3345-3349.

[13]Posch MG,Panek A,Kersten A,et al.Plasma HER-2 levels are not associated with cardiac function or hypertrophy in control subjects and heart failure patients[J].Int J Cardiol,2010,145(1):105-106.

[14]韓冬,徐煌,李文浩,等.HER-2基因RNA干擾質粒對SK-BR-3細胞增殖及凋亡的影響[J].中國實驗診斷學,2011,15(5):802-805.

Experimental study on the effect of trastuzumab on the damage of myocardial cells

LIU Wei-dong1,YE Ying-xiang1*,YANG Jie-hong2

(1.Department of Pharmacy,Yiwu Central Hospital,Yiwu 322000,China; 2.Basic Medical College of Zhejiang Chinese Medicine Univefrsity,Hangzhou 310053,China)

Objective To explore the effects and mechanism of trastuzumab on cardiac function of rats.Methods50 SD rats were randomly divided into observation group (n=25) and control group (n=25),rats in observation group were injected with trastuzumab for 7 d; rats in control group were intraperitoneally injected with physiological saline,with the same volume and injection time as observation group.The cardiac function was detected by cardiac ultrasonography before and after injection,TUNEL technique was used to determine the cell apoptosis,and the myocardial cell Caspase-3 activity was detected.ResultsThe LVEDd,LVESd of rats in observation group significantly expanded at 1 weeks after administration,and the LVPWDd,LVPWSd were significantly thinner,LVEF and LVFS significantly reduced,there were significant differences between the two groups (P<0.05).The apoptosis index of observation group increased,and the Caspase-3 activity enhanced(P<0.05).ConclusionTrastuzumab can lead to myocardial cell damage,and the mechanism may be related to the activation of Caspase-3 and promoting myocardial cell apoptosis.

Trastuzumab; Cardial function; Apoptosis

2014-10-27

1.浙江省義烏市中心醫院藥劑科，浙江 義烏322000；2.浙江中醫藥大學基礎醫學院，杭州 310053

國家自然科學基金(81073139)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505008

*通信作者