柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率研究

李季泓

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·藥學(xué)研究·

柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率研究

李季泓

目的 研究柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率。方法使用平衡透析法模擬柚皮苷在體內(nèi)與血漿蛋白結(jié)合的過程，并建立測(cè)定柚皮苷的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)方法，測(cè)定低、中、高3個(gè)濃度(100、600、3 600 ng/mL)的柚皮苷在透析袋內(nèi)血漿中和透析袋外緩沖液中的濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度的柚皮苷在體外與大鼠的平均血漿蛋白結(jié)合率分別為91.5%、90.5%和96.3%，3個(gè)濃度之間的血漿蛋白結(jié)合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論柚皮苷與大鼠血漿蛋白高度結(jié)合。

柚皮苷；血漿蛋白結(jié)合率；大鼠；平衡透析法

0 引言

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物，同時(shí)也是化橘紅、骨碎補(bǔ)、枳實(shí)等中藥的主要有效成分之一[1]。研究表明，柚皮苷具有降脂、抗腫瘤、解痙、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血糖等藥理作用[2-6]。柚皮苷在體內(nèi)可通過與腸內(nèi)P-糖蛋白交互作用影響藥物的吸收，還能影響細(xì)胞色素P450的活性，從而影響此酶相關(guān)底物的代謝[7]。

血漿蛋白結(jié)合率是藥物代謝過程中的一個(gè)重要參數(shù)之一，目前關(guān)于柚皮苷的血漿蛋白結(jié)合率研究的文獻(xiàn)報(bào)道很少。本研究采用平衡透析法研究了柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率，為進(jìn)一步闡述柚皮苷的體內(nèi)代謝行為和藥效學(xué)提供了依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步提高以柚皮苷為主要活性成分的藥物的臨床合理應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Thermp TSQ Quantum Access液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源(ESI)(美國(guó)Thermo公司)；Sigma冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；MD25透析袋，截留范圍8 000～14 000(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。柚皮苷對(duì)照品(110722-200309，純度>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；橙皮苷對(duì)照品(110721-200211，內(nèi)標(biāo)，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；純凈水由MilliQ純水制備系統(tǒng)制備；其余試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物 健康Wistar大鼠，雄性，體重(200±10.0)g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取柚皮苷對(duì)照品2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為200 μg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液2.5 mL，用甲醇稀釋至25 mL，配成濃度為20 μg/mL的工作溶液，吸取該溶液適量進(jìn)行一系列稀釋，得到系列濃度的對(duì)照品溶液和低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)溶液。

2.2 空白透析液的配制 準(zhǔn)確稱量磷酸氫二鉀14.11 g，磷酸二氫鉀2.59 g，氯化鈉1.99 g，以適量超純水溶解，并補(bǔ)充體積至1 L，得pH 7.4磷酸緩沖液，即空白透析液。

2.3 空白大鼠血漿的制備 取Wistar大鼠5只，眼眶靜脈取血，置肝素抗凝離心管中，3 500 r/min離心5 min，分離血漿，混合，備用。

2.4 LC-MS/MS分析條件

2.4.1 液相色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸(25∶75，v/v)；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 ESI源，采用正離子檢測(cè)模式，離子噴射電壓(IS)：4 000 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；鞘氣(N2)：40 L/min；輔助氣(N2)：10 L/min；掃描方式為選擇性離子監(jiān)測(cè)(SRM)；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為柚皮苷：m/z 579→271和橙皮苷 m/z 609→301，碰撞能量分別為30 eV和25 eV。

2.5 樣品處理

2.5.1 透析內(nèi)液血漿樣品的預(yù)處理 精密吸取透析平衡后的袋內(nèi)血漿50 μL，置于1.5 mL具塞試管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液(1 000 ng/mL)和50 μL甲醇，混勻，然后加入250 μL甲醇，渦旋1 min混合均勻，10 000 r/min離心5 min，取上清10 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5.2 透析外液樣品的預(yù)處理 取透析外液，用孔徑0.45 μm的水系過濾器過濾后吸取50 μL，依次加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液、50 μL甲醇，渦旋混合均勻，取10 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.6 分析方法驗(yàn)證考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿或空白透析液50 μL，加入柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液50 μL，配制相當(dāng)于空白血漿或空白透析液中濃度為50、150、500、1 000、2 000和5 000 ng/mL的樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法操作，建立工作曲線。用加權(quán)最小二乘法[8]以柚皮苷的峰面積(y)對(duì)其濃度(c)作圖，求得直線回歸方程。

2.6.2 準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿或空白透析液50 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，配成低、中、高3個(gè)濃度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC樣品。考察方法的日內(nèi)和日間精密度(RSD，%)和準(zhǔn)確度(RE，%)。

2.6.3 提取回收率 取空白血漿50 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個(gè)QC濃度，每個(gè)濃度3個(gè)樣本，考察方法的提取回收率。

2.6.4 穩(wěn)定性 取空白血漿50 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個(gè)濃度，考察血漿樣品處理后室溫放置4 h和-20 ℃保存1周的穩(wěn)定性。

2.7 血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定 本研究采用平衡透析法研究柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率。將透析袋剪成約10 cm左右的小段，用蒸餾水煮沸5 min，再用60 ℃蒸餾水沖洗2 min后在緩沖液中浸泡，4 ℃保存?zhèn)溆谩⑻幚砗蟮耐肝龃欢苏郫B，結(jié)扎，將1 mL空白血漿加入透析袋內(nèi)，將透析袋另一端扎緊，將其懸浮于盛有15 mL緩沖液的廣口瓶中，膜外緩沖液中樣品質(zhì)量濃度分別為100、600和3 600 ng/mL，將透析袋內(nèi)外液面調(diào)節(jié)至同一水平面，并避免透析袋貼于瓶壁。將瓶口密封后，于4 ℃靜置48 h至藥物擴(kuò)散平衡。透析結(jié)束后，使用10%高氯酸溶液檢查透析外液有無蛋白漏出，有漏出者視為作廢。平衡結(jié)束后，分別吸取袋內(nèi)、袋外樣本，采用建立的LC-MS/MS方法測(cè)定其濃度，并使用下列公式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：PB ratio(%)=(Cinside-Coutside)/Cinside×100%，其中，PB ratio為血漿蛋白結(jié)合率；Cinside為袋內(nèi)血漿中藥物的濃度；Coutside為袋外透析液中藥物的濃度。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證 在本研究條件下，空白血漿、空白透析液不干擾柚皮苷的測(cè)定(見圖1)。在空白血漿或空白透析液中，柚皮苷在50.0～5 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.998)，典型回歸曲線分別為y=0.001 4+0.028 2 c和y=0.003 2+0.045 4 c，方法的定量下限為50.0 ng/mL。透析內(nèi)液和透析外液低、中、高3個(gè)濃度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC樣品連續(xù)測(cè)定3 d的準(zhǔn)確度和精密度良好，日間和日內(nèi)精密度均在±15%之間，準(zhǔn)確度在-7.82～6.45之間。透析袋內(nèi)血漿中柚皮苷的提取回收率在90.2%～93.5%之間。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明血漿樣品在室溫放置4 h和-20 ℃保存1周穩(wěn)定。

3.2 透析平衡時(shí)間的確定 為了考察透析平衡時(shí)間，將處理過的透析袋一端扎緊，吸取1 mL空白血漿加入透析袋內(nèi)，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有15 mL含藥緩沖液(600 ng/mL)的廣口瓶中。將瓶口密封后，置于37 ℃水浴中，分別在12、24、36、48和60 h吸取透析袋內(nèi)外液適量進(jìn)行LC-MS/MS分析，測(cè)定透析袋內(nèi)外液的濃度，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算透析袋內(nèi)外柚皮苷的質(zhì)量濃度，以二者比值確定藥物從袋內(nèi)外自由擴(kuò)散達(dá)到平衡的時(shí)間。結(jié)果顯示，48 h時(shí)，袋內(nèi)、外溶液中柚皮苷的質(zhì)量濃度相等，表明擴(kuò)散48 h已達(dá)到平衡，因此設(shè)定平衡透析時(shí)間為48 h。

圖1 袋內(nèi)血漿中柚皮苷的典型HPLC-MS/MS色譜圖

3.3 血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定 柚皮苷的大鼠血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果見表1，低、中、高3個(gè)濃度的柚皮苷的血漿蛋白結(jié)合率在90.5%～96.3%之間。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同濃度樣品的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)濃度之間的血漿蛋白結(jié)合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 柚皮苷大鼠血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果

4 討論

藥物血漿蛋白結(jié)合是指藥物與血漿中的蛋白結(jié)合，形成藥物-大分子復(fù)合物[9]。藥物與血漿蛋白之間的結(jié)合反應(yīng)對(duì)藥物的消除有重要影響，通常情況下，血漿蛋白結(jié)合率高的藥物入血后分布較慢，消除半衰期較長(zhǎng)。本文研究的結(jié)果顯示，柚皮苷的血漿蛋白結(jié)合率較高，約為70%。文獻(xiàn)報(bào)道[10]，口服給藥后柚皮苷的消除半衰期約為5 h，應(yīng)屬于常速消除的藥物，與其較高的血漿蛋白結(jié)合率所提示的消除時(shí)間較長(zhǎng)不相吻合，這可能與柚皮苷在腸內(nèi)細(xì)菌作用下發(fā)生脫糖基化反應(yīng)，主要以苷元形式吸收入血有關(guān)[11]。

血漿蛋白結(jié)合率的研究方法主要有平衡透析法、超過濾法、超速離心法和凝膠過濾法等[12]，而平衡透析法是研究血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇此方法來測(cè)定柚皮苷的血漿蛋白結(jié)合率。

[1] 蘇玲,劉啟德.柚皮苷生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)研究新進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理,2008,2(10):74-80.

[2] Jagetia GC,Reddy TK.Alleviation of iron induced oxidative stress by the grape fruit flavanonenaringin in vitro [J].ChemBiol Interact,2011,190(2-3):121-128.

[3] Kanno S,Shouji A,Tomizawa A,et al.Inhibitory effect of naringin on lipopolysaccharide(LPS)-induced endotoxin shock in mice and nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages[J].Life Sci,2006,78(7):673-681.

[4] Balestrieri ML,Castaldo D,Balestrieri C,et al.Modulation by flavonoids of PAF and related phospholipids in endothelial cells during oxidative stress[J].J Lipid Res,2003,44(2):380-387.

[5] Gorinstein S,Leontowicz H,Leontowicz M.Effect of hesperidin and naringin on the plasma lipid profile and plasma antioxidant activity in rats fed a cholesterol-containing diet[J].J Sci Food Agric,2007,87(3):1257-1262.

[6] Singh D,Chander V,Chopra K.Protective effect of naringin,a bioflavonoid on glycerol-induced acute renal failure in rat kidney[J].Toxicology,2004,201(1-3):143-151.

[7] Lohner K,Schnabele K,Daniel H,et al.Flavonoids alter P-gpexpression in intestinal epithelial cells in vitro and in vivo[J].Mol Nutr Food Res,2007,51(3):293-300.

[8] 鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J].藥物分析雜志,1996,16:343-346.

[9] Otagiri M.Study on binding of drug to serum protein[J].Yakugaku Zasshi,2009,129(4):413-425.

[10]王喜軍,陳曦,曹洪欣,等.口服枳術(shù)丸后人體內(nèi)橙皮苷、柚皮苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(8):18-20.

[11]Griffiths LA,Smith GE.Metabolism of apigenin and related compounds in the rat.Metabolite formation in vivo and by the intestinal microflora in vitro[J].Biochem,1972,128(4):901- 911.

[12]Howard ML,Hill JJ,Galluppi GR,et al.Plasma protein binding in drug discovery and development[J].Comb Chem High Throughput Screen,2010,13(2):170-187.

Study on plasma protein binding rate of naringin in rats

LI Ji-hong

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

Objective To study the plasma protein binding rate of naringin in rats.MethodsUnder three different concentrations (100,600 and 3 600 ng/mL),this paper used equilibrium dialysis method to imitate the binding process between naringin and the plasma protein of rats,and determined the concentration of naringin in and out of the dialysis membrane by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.The binding rate was calculated.ResultsUnder the experimental concentrations,the plasma protein binding rates of naringin in rats were 91.5%,90.5% and 96.3% at low,middle and high concentrations,respectively.There was no significant difference among the three concentrations.ConclusionNaringin is highly bound to plasma proteins in rats.

Naringin; Plasma protein binding rate; Rat; Equilibrium dialysis

2014-01-15

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，沈陽 110032

10.14053/j.cnki.ppcr.201505020