苦芪滴丸中氧化槐果堿在大鼠血漿中的藥代動力學研究

董曉茜，陳 賀，戚哲源，朱婉玲，張振秋*

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苦芪滴丸中氧化槐果堿在大鼠血漿中的藥代動力學研究

董曉茜1，陳 賀1，戚哲源1，朱婉玲2，張振秋2*

目的 建立測定血漿中氧化槐果堿濃度的高效液相色譜法，并用此方法進行苦芪滴丸中氧化槐果堿的藥代動力學研究。方法色譜柱為Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL。結果血漿中氧化槐果堿的線性范圍：0.20～20 μg/mL，r=0.993，最低檢測限為0.20 μg/mL。日內、日間精密度及準確度、提取回收率符合要求。6只大鼠灌胃給藥8.5 mg/kg苦芪滴丸后，血漿中氧化槐果堿Tmax為(4.03±0.72)h，Cmax為(4.00±0.54)ng/mL，t1/2為(0.05±0.66)h，采用梯形法計算，AUC0-t為(30.70±0.54)μg·h/mL，AUC0-∞為(30.8±0.32)ng·h/mL。結論本方法簡便、快速、準確、專屬性強，可用于苦芪滴丸中氧化槐果堿的藥代動力學研究。

高效液相色譜；黃芪；苦參；氧化槐果堿；藥代動力學

0 引言

中藥藥對是中醫辨證論治理論精髓的具體體現，處方或配伍的細微變化往往表現出藥效和適應證的顯著差異。近幾年，對組成較小或較簡單的復方-藥對的研究較多，但大多是在化學成分的含量和變化、藥理作用等方面，對藥對在動物體內的藥物代謝動力學的研究還較少。

苦芪滴丸是黃芪和苦參藥材以1∶2配比經醇提后制得，主要含皂苷類和生物堿類物質。兩藥配伍，藥味雖少，卻寒熱并用，補瀉同施，升降相隨，共奏健脾益氣，清心解毒之功。適用于病毒性心肌炎氣虛濕毒內侵之虛實夾雜證。氧化槐果堿是苦芪滴丸的主要功效成分之一，本文采用高效液相色譜法測定6只大鼠給藥后血漿中氧化槐果堿的濃度，考察了方法的線性范圍、精密度、準確度、回收率和穩定性等效能指標。血漿樣品處理采用液-液萃取，考察了提取回收率，并計算藥物動力學參數。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 日本島津N2000高效液相色譜系統(配有一元泵，可變波長紫外檢測器，脫氣機，柱溫箱和N2000工作站)；電子分析天平，傲豪斯公司；TGL-16C高速離心機，海安亭科學儀器廠；微量移液器，上海求精玻璃儀器廠；WX-80A微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；FJ-200高速分散均質機，上海標本模型廠。

1.2 藥品與試劑 黃芪、苦參藥材均購自河北安國，經遼寧中醫藥大學藥學院王冰教授鑒定黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hisao的干燥根，苦參為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根；氧化槐果堿對照品(批號：111652-200301)和士的寧(批號：0705-200306)對照品，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈及無水乙醇均為色譜純，購自天津凱信化學工業有限公司；磷酸、氯仿均為分析純，購自華北地區特種化學試劑開發中心(天津)。

1.3 實驗動物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。

2 血漿中氧化槐果堿分析方法

2.1 色譜條件 分析柱：Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長：220 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品系列濃度溶液 精密稱取氧化槐果堿適量，用甲醇溶解制成1.00 mg/mL的儲備液。分別精密量取儲備液適量，用甲醇逐級稀釋成濃度為2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的標準系列溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 內標溶液 精密稱取士的寧適量，用甲醇溶解制成245 μg/mL的儲備液。取0.5 mL內標儲備液至50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成2.5 μg/mL的內標溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品的處理 取血漿500 μL，加入內標溶液50 μL，渦旋混合1 min，加水飽和碳酸鈉100 μL，渦旋混合1 min，加乙腈200 μL，渦旋混合1 min，加氯仿1.3 mL，渦旋混合5 min，離心(3 000 r/min)5 min，取下層有機相置另一試管中，空氣流下(40 ℃)吹干，殘渣加流動相50 μL溶解，進樣20 μL。

2.4 分析方法考察

2.4.1 方法的專屬性 血漿樣品測定色譜圖表明，空白血漿樣品中內源性物質不干擾氧化槐果堿的測定，空白樣品添加標準品色譜圖表明，氧化槐果堿色譜峰tR為17.5 min，內標士的寧tR為10.7 min，如圖1所示。

圖1 方法專屬性試驗色譜圖

2.4.2 標準曲線與線性范圍 取大鼠空白血漿500 μL，各加入氧化槐果堿標準系列溶液50 μL，制成相當于氧化槐果堿濃度為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL的模擬血漿樣品，按“血漿樣品的分析方法”操作，每一濃度進行3樣本分析，進樣20 μL，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標、待測物與內標物峰面積比值為縱坐標，用加權(w=1/χ2)最小二乘法進行回歸分析，求得直線回歸方程即為標準曲線。回歸方程：A=0.589 C+0.089 8，r=0.976 4

2.4.3 方法精密度與準確度 取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項下的方法制成低、高兩個濃度(氧化槐果堿濃度分別為0.5、16.0 μg/mL)的質量控制(QC)樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續測定3 d，根據當日標準曲線計算QC樣品測得濃度，根據QC樣品測定結果計算本法的精密度與準確度。氧化槐果堿在低、高濃度的日間RSD分別為6.38%、4.7%，日內RSD分別為6.43%、4.39%，回收率分別為101.3%、90.9%。

2.4.4 提取回收率和溶液穩定性 取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項下方法制備低、高兩個濃度(氧化槐果堿濃度分別為0.5、16.0 μg/mL)模擬血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析，并與配制的相應濃度未被處理溶液比較，以每一濃度兩種處理方法峰面積比值計算本方法提取回收率。內標物(0.024 5 mg/mL)提取回收率試驗方法相同。見表1。

表1 氧化槐果堿和內標物(士的寧)的提取回收率

取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項下方法制備氧化槐果堿低、高兩個濃度QC樣品(每濃度3樣本分析)，在室溫下于不同時間測定。結果表明，處理后的氧化槐果堿樣品溶液在室溫放置12 h內穩定。取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項下方法制備氧化槐果堿低、高兩個濃度QC樣品(每濃度3樣本分析)，凍融2循環穩定性考察。見表2。

表2 模擬血漿樣品室溫放置12 h及凍融2循環穩定性考察結果(μg/mL)

2.4.5 未知樣品的測定與質量控制 未知血漿樣品測定時，每天建立一條標準曲線，隨行測定低、高連個濃度(雙樣本)QC樣品。根據當日標準曲線，計算QC樣品和未知樣品的濃度，當QC樣品RSD≤15%時，當日數據方可接受。

2.5 大鼠藥物動力學研究 取健康雌、雄大鼠各3只，隨機分為2組。實驗前禁食24 h，自由飲水，取空白血0.5 mL后，按8.5 mg/kg大鼠體重灌胃給予苦芪滴丸(相當于氧化槐果堿含量14.5 mg/g)，于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置于預先肝素化的離心管中，離心5 min(10 000 r/min)，得血漿。

3 結果

對6只健康Wistar大鼠給予灌胃氧化槐果堿0.014 5 mg/kg，之后采用HPLC法測定6只健康Wistar大鼠灌胃給藥后的血漿藥物濃度，根據血藥濃度-時間數據，計算主要藥物動力學參數，見表3，藥時曲線見圖2。

表3 6只健康Wistar大鼠灌胃給藥后的藥動學參數

圖2 6只大鼠灌胃給藥后的平均血藥濃度-時間曲線

4 討論

4.1 流動相的影響 本文采用士的寧做內標，在方法的建立過程中，考察了不同流動相配比對峰形和分離度的影響[1-3]。曾采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-乙腈-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-無水乙醇-磷酸溶液為流動相，結果乙腈-無水乙醇-磷酸溶液為流動相時分離效果較好。但試驗中發現，磷酸溶液的酸度對分離效果有較大影響。因此試用了各種配比的乙腈-無水乙醇-磷酸溶液，最終確定用乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液(86∶8∶6)作為流動相。

4.2 堿化試劑的選擇 本文考察了用強堿進行堿化，提取回收率低。經試驗發現，水飽和碳酸鈉堿化后提取回收率最高，使用其他堿提取回收率有所降低，因此最終選擇用水飽和碳酸鈉堿化。

4.3 提取劑的選擇 本文參照文獻考察了乙醚-氯仿和乙腈-氯仿對氧化槐果堿樣品提取的影響[4-6],發現樣品在乙腈-氯仿中的溶解度大于在乙醚-氯仿中的溶解度，用乙腈-氯仿作為提取劑提取回收率高于用乙醚-氯仿作為提取劑的提取回收率，所以選擇乙腈-氯仿作為提取劑。

[1] 冷曉紅，陳海燕，郭鴻雁，等.不同提取方法對苦豆子中氧化槐果堿與槐果堿含量的影響[J].西北藥學雜志,2013,28(5):457-458.

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[3] 蔡凡,張芳向,鄒振紅,等.HPLC法同時測定三物黃芩湯中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿[J].航空航天醫學雜志,2012,23(11):1333-1334.

[4] 張蕾,王志偉,廉建偉，等.HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的濃度及其藥代動力學[J].藥學學報,2008,43(8):843-847.

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Pharmacokinetic study on oxymatrine in Kuqi drop pills in rat′s plasma

DONG Xiao-qian1,CHEN He1,QI Zhe-yuan1,ZHU Wan-ling2,ZHANG Zhen-qiu2*

(1.Laboratory of Clinical Pharmacy，Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province，Shenyang 110034，China; 2.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To establish an HPLC method for the determination of oxysophocarpin in rat plasma,and study the pharmacokinetics of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.MethodsThe analytical column was Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm); mobile phase: acetonitrile-ethanol-3% phosphoric acid water (86∶8∶6); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 220 nm; injection volume: 20 μL.ResultsThe linear concentration range of plasma oxysophocarpin was 0.20～20 μg/mL,r=0.993,the lower limits of quantificati were 0.20 μg/mL.The intra-day and inter-day precision,accuracy,extraction recoveries met the requirement.Six rats were fed by gavage administration of 8.5 mg/kg Kuqi drop pills,the plasma oxysophocarpin Tmaxwas (4.03±0.72)h,Cmaxwas (4.00±0.54)ng/mL,t1/2was (0.053±0.66)h,AUC0-twas (30.70±0.54)μg·h/mL,AUC0-∞was (30.8±0.32)ng·h/mL.ConclusionThe method is simple,rapid,accurate,specific,it can be used for the pharmacokinetic study of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.

HPLC; Radix astragali; Radix flavescentis ait; Oxysophocarpin; Pharmacokinetics

2014-09-29

1.遼寧省中醫藥研究院，沈陽 110034；2.遼寧中醫藥大學藥學院，大連 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201505021