聯合應用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉化生長因子-β1、活化素-A水平的影響

孟祥珍　韓月肖　張方琪　李志奎

聯合應用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉化生長因子-β1、活化素-A水平的影響

孟祥珍韓月肖張方琪李志奎

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導致了氣道重塑的病理修復，并最終導致氣道高反應性和氣流受限[1-2]。

哮喘的發病機制非常復雜，目前為止還不完全清楚。經典理論認為輔助性T細胞1型(Thl)/輔助性T細胞2型(Th2)的比例失衡，尤其是Th2及其產物(IL-4、IL-5、IL-13)分泌亢進是哮喘的主要發病機制。IL-4、IL-5在哮喘發病機制中扮演著非常重要的角色,本課題組前期研究發現IL-4突變體(interleukin-4 mutant, IL-4MT)和IL-5可容性受體(soluble interleukin-5 receptor α, sIL-5Rα)對小鼠的氣道炎癥有明顯的緩解作用。轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)、活化素-A (activin-A, Act-A)均是TGF-β超家族的成員，可由多種炎性細胞和結構性細胞分泌，比如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞、成纖維細胞等。研究發現，Act-A是免疫應答方面的重要調節因子，并且在哮喘發病機理、肺纖維化及氣道重塑的進程中發揮重要作用[3-10]。TGF-β1作為纖維化和免疫調節的重要細胞因子，在哮喘氣道重塑方面也發揮著關鍵作用[11]。本實驗聯合應用IL-4突變體(拮抗IL-4/IL-13)及IL-5可溶性受體α(拮抗IL-5)對哮喘小鼠進行靶向干預，旨在觀察其對哮喘小鼠BALF及血清中TGF-β1 、Act-A水平的影響，并探討其作用機理。

材料與方法

一、實驗動物

50只6～8周齡的清潔級BALB/c雌性小鼠，體質量(21±3)g，購于第四軍醫大學實驗動物中心，無卵蛋白飼料喂養，飼養環境為溫度為(18±4)℃，濕度為57%±10%。

二、試劑和儀器

OVA (美國Sigma公司)，氫氧化鋁(河南新鄉華蘭生物公司)，生理鹽水， IL-4MT(Q116D,Y119D)及sIL-5Rα(由本課題組與北京義翹神州生物技術有限公司合作研發，51 084-M08B，51 154-M08B)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，BSA-CW電子天平(德國賽多利斯集團)，402型超聲霧化器(上海四菱醫療器械廠)，低溫高速離心機(美國Backman公司)，全自動酶聯免疫分析儀(美國Thermo公司)。

三、實驗方法

1. 動物分組：50只實驗小鼠采用隨機數字表法按每組10只隨機分為5個組，即對照組、哮喘組、IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯合治療組。

2．哮喘模型的建立與干預：各組小鼠(對照組除外)分別于第0、7、14 天腹腔注射20 μg OVA和20 mg氫氧化鋁凝膠0.9%氯化鈉混合液 200 μl致敏，而對照組小鼠腹腔注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。第21至27天將各組小鼠(對照組除外)置于封閉容器中，超聲霧化吸入5% OVA生理鹽水誘發哮喘，每次30 min，每天一次。其中IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯合治療組小鼠分別于激發前30 min腹腔注射IL-4MT 100 μg、sIL-5Rα100 μg及聯合應用IL-4MT、sIL-5Rα各100 μg進行干預，而對照組和哮喘組小鼠于激發前30 min給予腹腔注射相同體積生理鹽水，共7 d，對照組小鼠用生理鹽水進行激發。

3．樣本采集：各組小鼠在末次激發24 h后眼球取血，于4 ℃靜置30 min后，以離心半徑 8 cm，3 000 r/min離心15 min留取血清，將血清凍存于-20 ℃冰箱中待檢。各組小鼠處死后進行氣管插管，0.8 ml生理鹽水灌洗雙肺，停留并按摩肺部片刻后緩慢回收支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)，重復三次，4 ℃，以離心半徑 8 cm，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存備用。

4．細胞因子的測定：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測各組小鼠BALF及血清中TGF-β1、Act-A水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書的步驟進行。

四、統計學方法

結果

一、 BALF、血清中TGF-β1(活化)的水平

與對照組相比，哮喘組BALF及血清中TGF-β1(活化)水平顯著升高，差異有統計學意義(t值分別為10.619；21.380，P值均<0.01)。與哮喘組比較，IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯合治療組BALF及血清中TGF-β1(活化)水平顯著下降，差異有統計學意義(t值分別為2.926，5.746，8.375；6.528，4.480，14.745，P值均<0.01)；聯合治療組與IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組比較，BALF及血清中TGF-β1(活化)水平進一步下降，差異有統計學意義(t值分別為6.387，2.423；10.7000，1.835，P值均<0.05)，提示聯合治療的效果更好，見表1。

表15組小鼠BALF及血清中TGF-β1(活化)的水平

組 別TGF-β1(BALF)TGF-β1(血清)對照組76.94±10.73489.74±40.32哮喘組162.51±23.12a1130.21±79.94aIL-4MT治療組135.88±13.54bc934.90±53.41bcsIL-5Rα治療組110.76±16.40bc862.35±49.52bc聯合治療組95.94±9.86b685.33±50.86b

注：與對照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01；與聯合治療組比較，cP<0.05；TGF-β1：轉化生長因子-β1；BALF：支氣管肺泡灌洗液

二、 BALF、血清中Act-A的水平

與正常組相比，哮喘組BALF及血清中Act-A水平顯著升高，差異有統計學意義(t值分別為31.772，27.153，P值均<0.01)。與哮喘組比較，IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯合治療組BALF及血清中Act-A水平顯著下降，差異有統計學意義(t值分別為11.425，9.618，17.017；8.044，5.394，18.753，P值均<0.01)；聯合治療組與IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組比較，BALF及血清中Act-A水平進一步下降，差異有統計學意義(t值分別為4.409，8.185；10.417，12.920，P值均<0.01)，提示聯合治療的效果更好，見表2。

表25組小鼠BALF及血清中Act-A 水平

組 別Act-A(BALF)Act-A(血清)對照組272.87±21.98550.17±50.86哮喘組863.98±54.78a1341.43±69.94aIL-4MT治療組597.53±49.97bc1076.50±56.33bcsIL-5Rα治療組656.09±41.95bc1158.21±73.12bc聯合治療組512.76±36.15b794.56±50.46b

注：與對照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01；與聯合治療組比較，cP<0.01；BALF：支氣管肺泡灌洗液；Act-A：活化素-A

討論

哮喘是嚴重影響人類健康的最常見的慢性疾病之一，兒童和成年人均可發病。哮喘的發病率在全球呈逐年上升趨勢，約有3億人患病[12]。眾所周知，氣道重塑是哮喘疾病的重要特征之一，研究表明氣道重塑是哮喘患者肺功能下降的主要原因之一[13]。機體受變應原刺激后，Th2細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13分泌量增加，多種炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、肥大細胞等參與其中，釋放多種炎性介質，從而引起氣道的慢性炎癥，最終導致氣道的高反應性和和氣道重塑[13]。

TGF-β超家族是一組具有廣泛生物學作用的蛋白質家族，包括細胞的增殖，組織分化、重塑和形態形成，細胞的遷移和凋亡，免疫應答等。TGF-β1、Act-A均是TGF-β超家族的成員，可由炎癥細胞及氣道結構性細胞分泌，刺激氣道上皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞的增生，是氣道重塑的重要調節因子[14]。

文獻報道IL-5的過表達可誘導嗜酸性粒細胞、TGF-β1的增多，促進氣道重塑[15]。相反，在IL-5缺乏的哮喘小鼠模型中，變應原刺激誘發的過敏反應明顯減弱，BALF和支氣管周圍組織中的嗜酸性粒細胞量下降，表達TGF-β1陽性細胞數量減少[16]。而在培養的人支氣管上皮細胞中IL-4與IL-13均可誘導TGF-β1成劑量依賴型增加。IL-13可誘導TGF-β1的表達，而IL-13過表達引起的氣道重塑主要由TGF-β介導，協同促進氣道重塑[17]。有文獻報道在哮喘兒童的BALF及血清中TGF-β1的水平較正常人均明顯增高[18]。 同樣，IL-13可以調節Act-A的分泌， IL-13基因敲除小鼠Act-A的濃度可明顯降低，從而減輕嚴重的過敏性氣道炎癥, 提示IL-13-Act-A 軸可能是哮喘氣道重塑的機制之一[19]。IL-13基因敲除小鼠可減少IL-4和IL-5的產生，不排除IL-4與IL-5可能會對Act-A的分泌產生影響。Act-A同時也可以誘導TGF-β1的產生，共同促進氣道重塑。Act-A的水平在哮喘患者的BALF及血清中較正常人均可明顯增高[19-20]。

本研究結果表明對照組小鼠的BALF及血清中存在一定水平的TGF-β1和Act-A，但哮喘組小鼠BALF及血清中的TGF-β1、Act-A水平較對照組明顯增高。與哮喘組比較，IL-4MT及sIL-5Rα能一定程度地降低哮喘小鼠TGF-β1、Act-A的水平，而聯合應用IL-4MT及sIL-5Rα則降低其水平更加顯著。本實驗通過應用IL-4突變體和IL-5可溶性受體阻斷IL-4、IL-5及IL-13與其受體的結合，拮抗IL-4、IL-5及IL-13，降低了TGF-β1、Act-A在BALF及血清中的水平，對減輕哮喘小鼠的氣道重塑有一定的作用。其作用機制尚有待今后更深入的研究。

參考文獻

1王長征. 改善支氣管哮喘控制現狀, 需要重視患者的長期管理[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2013, 6(4): 296-298.

2李喆, 莫琳芳, 任成山. 支氣管哮喘藥物治療現狀及進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2014, 7(5): 571-573.

3Tanaka H, Kawada N, Yamada T, et al. Allergen-induced airway inflammation and bronchial responsiveness in interleukin-5 receptor a chaindeficient mice[J]. Clin Exp Allergy, 2000, 30(6): 874-881.

4Nakajima H, Iwamoto I, Tomoe S, et al. CD4+D T-lymphocytes and interleukin-5 mediate antigen-induced eosinophil infiltration into the mouse trachea[J]. Am Rev Respir Dis, 1992, 146(2): 374-377.

5Leckie MJ, Brinke A, Khan J, et al. Effects of an interleukin-5 blocking monoclonal antibody on eosinophil, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response[J]. Lancet, 2000, 356 (9248): 2144-2148.

6Rothenberg ME, Klion AD, Roufosse FE, et al. Treatment of patients with the hypereosinophilic syndrome with mepolizumab [J]. N Engl J Med, 2008, 358(12): 1215-1228.

7Koike M, Nakamura K, Furuya A, et al. Establishment of humanized anti-interleukin-5 receptor alpha chain monoclonal antibodies having a potent neutralizing activity[J]. Hum Antibodies, 2009, 18(1-2): 17-27.

8Kolbeck R, Alexander Kozhich A, Koike M, et al. MEDI-563, a humanized anti-IL-5 receptor α mAb with enhanced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity Function [J]. Allergy Clin Immunol, 2010, 125(6): 1344-1353.

9Busse WW, Katial R, Gossage D, et al. Safety profile, pharmacokinetics,and biologic activity of MEDI-563, an anti-IL-5 receptor α antibody, in a phase I study of subjects with mild asthma[J]. Allergy Clin Immunol, 2010, 125(6): 1237-1244.

10Sideras P, Apostolou E, Stavropoulos A, et al. Activin, neutrophils,and inflammation: just coincidence?[J]. Semin Immunopathol, 2013, 35(4): 481-499.

11Ierodiakonou D, Postma DS, Koppelman GH, et al. TGF-beta1 polymorphisms and asthma severity, airway inflammation, and remodeling[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013, 131(2): 582-585.

12Anandan C, Nurmatov U, van Schayck OC, et al. Is the prevalence of asthma declining? Systematic review of epidemiological studies[J]. Allergy, 2010, 65(2): 152-167.

13Holgate ST. Pathogenesis of asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2008, 38(6): 872-897.

14Halwani R, Al-Muhsen S, Al-Jahdali H, et al. Role of transforming growth factor-beta in airway remodeling in asthma[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 44(2): 127-133.

15Al-Alawi M, Hassan T, Chotirmall SH. Transforming growth factor beta and severe asthma: a perfect storm[J]. Respir Med, 2014, 108(10): 1409-1423.

16Cho JY, Miller M, Baek KJ, et al. Inhibition of airway remodeling in IL-5-deficient mice[J]. J Clin Invest, 2004, 113(4): 551-560.

17Firszt R, Francisco D, Church TD, et al. Interleukin-13 induces collagen type-1 expression through matrix metalloproteinase-2 and transforming growth factor-beta1 in airway fibroblasts in asthma[J]. Eur Respir J, 2014, 43(2): 464-473.

18Jiang K, Chen HB, Wang Y, et al. Changes in IL-17 and TGF-beta1 levels in serum and bronchoalveolar lavage fluid and their clinical significance among children with asthma[J]. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 2013,15(8): 604-608.

19Hardy CL, Lemasurier JS, Olsson F, et al. Interleukin-13 regulates secretion of the tumor growth factor-{beta} superfamily cytokine activin A in allergic airway inflammation[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2010, 42(6): 667-675.

20Karagiannidis C, Hense G, Martin C, et al. Activin A is an acute allergen-responsive cytokine and provides a link to TGF-beta-mediated airway remodeling in asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117(1): 111-118.

(本文編輯：黃紅稷)

孟祥珍，韓月肖，張方琪，等. 聯合應用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉化生長因子-β1、活化素-A水平的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(3)： 275-278.

·論著·

【摘要】目的探討聯合應用白介素-4突變體(IL-4MT)及白介素-5可溶性受體(sIL-5Rα)對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及血清轉化生長因子-β1(TGF-β1)、 活化素-A(Act-A)水平的影響。方法50只雌性BALB/c小鼠被隨機分為對照組、哮喘組、IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組、聯合IL-4MT及sIL-5Rα治療組(簡稱聯合治療組)；哮喘組和各治療組分別給予卵蛋白(OVA)致敏和激發。其中，各治療組(IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組、聯合治療組)分別于激發前30 min腹腔注射IL-4MT 100 μg、sIL-5Rα 100 μg及IL-4MT、sIL-5Rα各100 μg進行干預，對照組和哮喘組給予生理鹽水代替；末次激發后收集小鼠BALF、血清；用ELISA法比較各組(BALF)及血清中TGF-β1、Act-A的水平變化。結果與對照組比較，哮喘組小鼠BALF及血清中的TGF-β1、 Act-A水平顯著升高(P<0.01)；與哮喘組比較，各治療組BALF及血清中TGF-β1、 Act-A水平明顯下降(P<0.01)；與單獨治療組相比，聯合治療組BALF及血清中的TGF-β1、 Act-A水平下降地更明顯(P<0.05)。結論聯合應用IL-4MT及sIL-5Rα可明顯降低哮喘小鼠BALF及血清中TGF-β1、Act-A水平，在減輕哮喘小鼠氣道重塑方面可能發揮了重要作用。

【關鍵詞】支氣管哮喘；白介素-4突變體；白介素-5可溶性受體α；轉化生長因子-β1；活化素-A

Effects of interleukin-4 mutant combined with soluble interleukin-5 receptor α on transforming growth factor-β1 and activin-A levels in bronchial alveolar lavage fluid and serum of asthmatic miceMengXiangzhen,HanYuexiao,ZhangFangqi,LiZhikui.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China

Correspondingauthor：LiZhikui,Email：lizhikui@fmmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of interleukin-4 mutant(IL-4MT) combined with soluble interleukin-5 receptor α(sIL-5 Rα) on transforming growth factor-β1(TGF-β1) and activin-A(Act-A) levels in bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and serum of asthmatic mice. MethodsFifty female BALB/c mice were randomly divided into 5 groups: the normal control group, the asthma group, the IL-4MT treatment group, the sIL-5Rα treatment group, the combination of IL-4MT and sIL-5Rα treatment group. Mice in asthma group and treatment groups were sensitized and challenged by OVA. Mice in treatment groups were respectively injected intraperitoneally with IL-4MT 100 μg, sIL-5Rα 100 μg and the combination of IL-4MT 100 μg and sIL-5Rα 100 μg 30 mins before challenged, while mice in normal group and asthma group received equal volume of saline. Then the levels of TGF-β1 and Act-A in BALF and serum were measured by ELISA. ResultsCompared with the normal group, the levels of TGF-β1 and Act-A in both BALF and serum of the asthma group were remarkably higher (P<0.01). Compared with the asthma group, treatment groups can effectively reduce the levels of TGF-β1 and Act-A (P<0.01). Compared with single treatment, the combined treatment group were more effective (P<0.05). ConclusionIL-4MT and sIL-5Rα could reduce TGF-β1 and Act-A levels in BALF and serum of asthmatic mice, which could be a useful therapeutic strategy to alleviate the airway remodeling of asthma.

【Key words】Bronchial asthma;Interleukin-4 mutant;Soluble interleukin-5 receptor α;Transforming growth factor-β1;Activin-A

收稿日期：(2015-01-12)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：李志奎，Email：lizhikui@fmmu.edu.cn

基金項目：作者單位： 710032 西安，第四軍醫大學西京醫院呼吸與危重癥醫學科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.03.001