HPLC法測定柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a，d的含量*

*基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制學(xué)重點(diǎn)學(xué)科青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012jzzdxk024)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012Z005)。

**第一作者：祝婧(1985—)，女，講師。研究方向：中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及炮制機(jī)理。Tel：0791-87118995.Email:277836041@qq.com。

HPLC法測定柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a，d的含量*

*基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制學(xué)重點(diǎn)學(xué)科青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012jzzdxk024)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012Z005)。

**第一作者：祝婧(1985—)，女，講師。研究方向：中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及炮制機(jī)理。Tel：0791-87118995.Email:277836041@qq.com。

★祝婧**鐘凌云龔千鋒張金蓮羅歡諶瑞林***(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南昌 330004)

摘要：目的 :以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量為指標(biāo)，考察不同炮制方法對柴胡中皂苷類成分含量的影響。 方法 :采用RP-HPLC法測定柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，色譜柱為Dikma Diamonsil C18( 250 mm ×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-水( 35∶65)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長210nm。結(jié)果 :柴胡經(jīng)不同的方法炮制后，柴胡皂苷a、d的含量有不同程度的變化，柴胡皂苷a的含量變化依次為: 生柴胡>酒麩柴胡>炒柴胡>酒柴胡≈鱉血柴胡>醋柴胡，柴胡皂苷d的含量變化依次為: 生柴胡>酒麩柴胡>鱉血柴胡>酒柴胡>炒柴胡>醋柴胡。 結(jié)論 :本方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好，可用于柴胡及其炮制品中柴胡皂苷a、d的含量測定，并為全面控制其質(zhì)量提供參考，為深入探討柴胡炮制的意義，提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柴胡；炮制品；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；HPLC

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurumscorzonerifol-iumWilld的干燥根[1]。具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效，主要含有揮發(fā)油、柴胡皂苷、多糖等成分。現(xiàn)在主要的炮制方法有醋制、酒制、蜜制、清炒、鱉血制、酒麩制等[2-3]。柴胡生品升散作用較強(qiáng)，臨床多用于解表退熱，炮制之后可起到“減毒、增效”的作用，各炮制品的功效不盡相同。中藥發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)為其中所含有的有效成分，柴胡中皂苷類成分是其發(fā)揮臨床療效的主要有效成分之一，柴胡經(jīng)過不同方法炮制之后所產(chǎn)生不同作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，即是其所含有效成分發(fā)生了變化。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同炮制方法對柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的影響，篩選出柴胡的優(yōu)勢飲片，為臨床規(guī)范、合理、有效的使用柴胡飲片提供理論基礎(chǔ)。

1材料

1.1儀器高效液相色譜儀(Dionex UltiMate3000)；PDA-3000二極管陣列紫外檢測器； Chromeleon工作站；Raytek Raynger ST20 紅外測溫儀(美國雷泰公司raytek)；KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)( 昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子分析天平( 梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

1.2試劑與試藥柴胡皂苷a(批號: 110777-200404 ) 和柴胡皂苷d(批號: 110777-200403) 對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；柴胡飲片購自樟市藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為傘形科植物北柴胡的干燥根；麥麩購自樟樹藥材市場；鱉血購自菜場；黃酒、米醋、蜂蜜均為市售。

2方法與結(jié)果

2.1不同柴胡炮制品的制備

2.1.1柴胡生品取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥。

2.1.2炒柴胡取凈柴胡片，文火炒至藥物表面顏色加深。

2.1.3 醋柴胡取凈柴胡片，加米醋(100g藥物用米醋20g) 悶潤，文火炒干即得 。

2.1.4酒柴胡取凈柴胡片，加黃酒(100g藥物用黃酒10g) 悶潤，文火炒干即得。

2.1.5酒麩柴胡先將麥麩均勻撒入熱鍋中(100g藥物用麥麩15g)，至起煙時(shí)投入經(jīng)黃酒(100g藥物用黃酒15g)悶潤過的凈柴胡片，文火炒至藥物表面顏色加深，篩去麥麩，放涼。

2.1.6鱉血柴胡取凈柴胡片，加鱉血及適量冷開水(100g藥物用鱉血13g) 悶潤，再文火炒干即得。

6種炮制品各取50g，分別粉碎，過三號篩，備用。

2.2色譜條件色譜柱: Dikma Diamonsil C18( 250 mm ×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相: 乙腈-水( 35：65)；流速: 1.0mL/min；柱溫: 30℃；檢測波長: 210nm；進(jìn)樣量: 20μL。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分離度良好，無其他雜質(zhì)干擾。

2.3對照品溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a對照品3.21mg，柴胡皂苷d對照品7.32mg，分別置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備分別取柴胡生品及炮制品各0.5g，精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25mL，密塞,于30℃超聲處理30min，濾過。用甲醇20mL分兩次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，置于60℃水浴鍋上揮發(fā)至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5mL容量瓶中,定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得。

2.5線性關(guān)系考察取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品溶液1，5，10，15，20 μL分別注入液相色譜儀，測定峰面積積分值，以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得柴胡皂苷a回歸方程Y=12.099X-2.3524，r=0.9998，表明在0.624～12.84μg范圍內(nèi)柴胡皂苷a線性良好；柴胡皂苷d回歸方程Y=4.9356X+4.364，r=0.9998，表明在1.464～29.28μg范圍內(nèi)柴胡皂苷d線性良好。

2.6精密度試驗(yàn)分別取柴胡皂苷a對照品溶液20μL與柴胡皂苷d對照品溶液20μL注入液相色譜儀，各連續(xù)進(jìn)樣5次,測定峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.33%和0.60%，表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一柴胡生品溶液，分別于0、2、4、8、12 h測定，結(jié)果在此范圍內(nèi)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的穩(wěn)定性較好，RSD 分別為2.01%和1.80%。

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)取柴胡醋炙品5份，每份0.5g，精密稱定，照“2.4”項(xiàng)方法制備，分別精密吸取此供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積，計(jì)算得RSD分別為1.78%和2.02%，表明重現(xiàn)性良好。

2.9加樣回收試驗(yàn)取已知含量的酒麩柴胡粉末(柴胡皂苷a含量為0.642mg/mL，柴胡皂苷d含量為1.464mg/mL) 0.25g, 精密稱定，共6份，加入適量柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品，照“2.4”項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的平均回收率分別為98.08% 和97.23%，RSD 分別為2.01%和1.70%。

品及不同炮制品粉末各0.5g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下供試品溶液制備方法及“2.2”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，測定峰面積，并根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量。結(jié)果見表1。

表1　柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a、d的含量(n=3)

3討論

3.1實(shí)驗(yàn)選取了柴胡生品及5種常用炮制品測定其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷a的含量。結(jié)果表明，柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a的含量變化依次為: 生柴胡>酒麩柴胡>炒柴胡>酒柴胡≈鱉血柴胡>醋柴胡，柴胡皂苷d的含量變化依次為: 生品>酒麩制品>鱉血制品>酒炙品>清炒品>醋炙品。炮制品中柴胡皂苷a、d 的含量相對于生品都有不同程度的下降，其中酒麩制品中含量最高，醋制品中含量最低。

3.2有研究證明[4], 柴胡皂苷有明顯的中樞抑制、抗炎、特異性阻礙膽堿酯酶和顯著的利尿作用，為柴胡發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，炮制后柴胡皂苷a、d 的含量相對于生品都有不同程度的下降有研究，有研究[8]認(rèn)為，可能是由于柴胡皂苷a、d 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在炮制的過程中，在加熱和輔料的共同作用下，易使環(huán)氧醚鍵開環(huán)發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成柴胡皂苷b1、b2所致。

3.3酒麩柴胡是江西樟幫特色炮制工藝[2]，選取雙重輔料黃酒與麥麩同時(shí)對藥物進(jìn)行炮制，具有緩和寒性，引藥上行，增強(qiáng)解表和里、升陽解郁的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒麩柴胡中柴胡皂苷a，d 的含量較之其他炮制品為高，說明經(jīng)過酒潤麩炒之后，其有效成分含量損失相較于其他炮制方法要少。故我們認(rèn)為，酒麩柴胡較之柴胡其他炮制品在飲片質(zhì)量方面具有一定的優(yōu)勢。究其原因，推測是由于輔料黃酒和麥麩中的成分復(fù)雜，某些成分在炮制過程中通過激活藥材中的分解酶、參與生成柴胡中所含游離型皂苷等直接或間接的方式，使得樟幫酒麩柴胡中柴胡皂苷含量較之其他炮制品更高。至于其具體原因以及輔料與有效成分含量之間的關(guān)聯(lián)性，還有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

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[8]白宗利．醋柴胡炮制原理及工藝研究[D]．沈陽: 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2008: 11-17．

Determination of Saikosaponin a and Saikosaponin d in Different Processing Products of Radix Bupleuri by HPLC

ZHU Jing, ZHONG Lin-yun, GONG Qian-feng, ZHANG Jin-lian, DAI Xi-ming

FacultyofPharmacy，JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China.

Abstract:Objective:Saikosaponin a,d are used as the marker ingredients，study the impact of different processing methods on the content of saikosaponin compounds in Radix Bupleuri.Methods Methods: Use RP-HPLC method to determine the content of saikosaponin a,d in different processing products of Radix Bupleuri.The column was Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm) with mobile phase of acetonitrile-water(35:65),the flow rate of 1.0mL/min.Column temperature was 30℃ with the detection wavelength of 210nm. Results：After being processed,the sequence of the content changes of saikosaponin a was as follows:raw product>processing with wine bran>processing with fried>processing with wine≈processing with turtle blood>processing with vinegar broiled,while content of saikosaponin d were:raw product>processing with wine bran>processing with turtle blood>processing with wine>processing with fried>processing with vinegar.Conclusion:The method is simple,reliable,reproducible.It can be used for processed products Radix Bupleuri saikosaponin a,d content determination and provide reference for full control of its quality,depth Radix Bupleuri concocted sense,provide some experimental basis.

Key words:Radix Bupleuri; Processed Products; Saikosaponin a; Saikosaporin d;HPLC

收稿日期：(2015-02-05)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

通信作者：***諶瑞林，男，主任中藥師。研究方向：中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。