蟲(chóng)草菌絲體HPLC指紋圖譜的研究*

*基金項(xiàng)目：十二五重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng) (2011ZX09201-201-30)；江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目(產(chǎn)學(xué)研合作KJLD13061)；江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(JZYC12A01)；江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(YC2013-S238)。

**第一作者：聶鶴云，男，助教。研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

蟲(chóng)草菌絲體HPLC指紋圖譜的研究*

*基金項(xiàng)目：十二五重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng) (2011ZX09201-201-30)；江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目(產(chǎn)學(xué)研合作KJLD13061)；江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(JZYC12A01)；江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(YC2013-S238)。

**第一作者：聶鶴云，男，助教。研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

★聶鶴云1**陳麗華1張清華1朱衛(wèi)豐1楊明2管詠梅1***(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌 330004；2.江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司南昌 330096)

摘要：目的：建立蟲(chóng)草菌絲體的HPLC指紋圖譜方法，為質(zhì)量控制提供一定參考依據(jù)。方法：以phenomenx.OOG-4435-EO-C18為色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0 mL/min；對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)以及聚類分析。結(jié)果：建立蟲(chóng)草菌絲體的HPLC指紋圖譜，確定9個(gè)共有峰；確定其相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積的比值，該方法能夠很好的鑒別不同生產(chǎn)廠家蟲(chóng)草菌絲體產(chǎn)品。結(jié)論：該方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可應(yīng)用于蟲(chóng)草菌絲體的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蟲(chóng)草菌絲體；高效液相；指紋圖譜；相似度

冬蟲(chóng)夏草(cordycepssinensis)，是麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體[1]，是一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。近年來(lái)，由于自然環(huán)境及開(kāi)采過(guò)度的影響，冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)量日益減少，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需要，價(jià)格居高不下，目前國(guó)內(nèi)已采用以天然蟲(chóng)草真菌發(fā)酵法獲得人工蟲(chóng)草菌，并且已經(jīng)在臨床上廣泛使用。目前市售發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉制劑有金水寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊以及至靈膠囊。這5種蟲(chóng)草菌絲產(chǎn)品中，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)載入2010版《中國(guó)藥典》的僅有金水寶膠囊、金水寶片及百令膠囊。寧心寶膠囊、心肝寶膠囊、至靈膠囊收載于衛(wèi)生部頒成方制劑標(biāo)準(zhǔn)中。百令膠囊檢測(cè)項(xiàng)包括薄層色譜法檢測(cè)麥角甾醇；高效液相色譜法測(cè)定腺苷類成分；金水寶片劑及金水寶膠囊劑檢測(cè)項(xiàng)包括薄層色譜法鑒別腺嘌呤、腺苷、尿苷成分；高效液相色譜法測(cè)定腺苷含量。此類檢測(cè)雖能對(duì)蟲(chóng)草菌絲類產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制，但卻難以區(qū)分類似產(chǎn)品。為了避免單一成分控制產(chǎn)品質(zhì)量的不足[2]，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC指紋圖譜對(duì)蟲(chóng)草菌絲類產(chǎn)品進(jìn)行研究，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)，聚類分析較為全面地鑒別不同廠家蟲(chóng)草菌絲體。

1儀器與材料

1.1儀器 GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，Agilent1260型高效液相儀(美國(guó)安捷倫)，KQ3200E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。BT25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2材料 百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司)，寧心寶膠囊(正大青春寶藥業(yè)有限公司)，至靈膠囊(大同市利群藥業(yè)有限責(zé)任公司)，心肝寶膠囊(長(zhǎng)天藥業(yè))，金水寶膠囊(江西濟(jì)民可信集團(tuán)有限公司)，見(jiàn)表1。

尿苷對(duì)照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：1065-101017)，鳥(niǎo)苷對(duì)照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：1081-110401)，腺苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110879-200202)，染料木素(南昌貝塔生物科技有限公司,批號(hào)：10362-201211)，麥角甾醇(南昌貝塔生物科技有限公司，批號(hào)：20042-201202)，大豆素、黃豆黃素對(duì)照品自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%；乙腈色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

表1　樣品來(lái)源

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1供試品的制備精密稱取金水寶、百令膠囊、至靈膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊各1g,分別倒入錐形瓶中，加入甲醇20mL，超聲30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2混合對(duì)照品溶液制備分別精密稱取腺嘌呤、腺苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、染料木素、大豆素、黃豆黃素、麥角甾醇5mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，即得100μg/mL的混合對(duì)照液，再過(guò)0.22μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1色譜條件十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為phenomenx.OOG-4435-EO(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇(B)-0.05%磷酸水(A)，梯度洗脫：0～10min，5%B；10～20min，5%～30%B；20～60min，30%～100%B；60～70min，100%B； DAD檢測(cè)器，體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10μL。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)精密稱取金水寶膠囊樣品(130907)，按照2.1項(xiàng)下的方法的處理，在2.3.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.34%～1.22%，共有峰相對(duì)峰面積>5%的峰面積值RSD在0.56%～1.45%，符合指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，精密度良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批次的樣品，按照2.1項(xiàng)下的方法制備6份供試品，在2.3.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.26%～1.08%，共有峰相對(duì)峰面積RSD在0.79%～1.88%，符合指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次金水寶膠囊(130907)新制備的供試品于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣HPLC分析，結(jié)果表明共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.45%～1.65%，共有峰相對(duì)峰面積RSD在0.62%～1.67%，符合指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，表明各成分在24h穩(wěn)定。

圖1　蟲(chóng)草菌絲體共有峰模式

2.4蟲(chóng)草菌絲體指紋圖譜的確立[3-5]

2.4.1蟲(chóng)草菌絲體共有峰的確立按上述液相色譜條件測(cè)定了 15份蟲(chóng)草菌絲體藥品(表1中的1～ 12號(hào)樣品),采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)( 國(guó)家藥典委員會(huì)，2004B版) 對(duì)12批次樣品色譜圖進(jìn)行分析，確定了9個(gè)共有峰，共有峰保留時(shí)間分別為2.52、3.17、3.56、4.51、6.10、7.85、14.85、64.95、69.90min，結(jié)果見(jiàn)圖1。選取9號(hào)峰位參照峰，計(jì)算蟲(chóng)草菌絲體其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表 2、3。

表2　12批蟲(chóng)草菌絲體共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3　12批蟲(chóng)草菌絲體共有峰相對(duì)峰面積

2.4.2不同廠家蟲(chóng)草菌絲指紋圖譜比較在相同的液相條件下分析5個(gè)不同產(chǎn)家12批蟲(chóng)草菌絲體產(chǎn)品,通過(guò)比較5種不同廠家的蟲(chóng)草菌絲體HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)不同種類的蟲(chóng)草菌絲體化學(xué)成分有一定的差異，5種蟲(chóng)草菌絲體中除寧心寶膠囊不含4、8號(hào)峰外，其余的都含上述8種化學(xué)成分，此外金水寶膠囊、至靈膠囊、心肝寶膠囊還含大豆素、黃豆黃素、染料木素，而百靈膠囊、寧心寶膠囊未檢測(cè)出這些成分，見(jiàn)圖3。

2.5聚類分析以 12批不同生產(chǎn)廠家的蟲(chóng)草菌絲體為研究對(duì)象，進(jìn)行指紋圖譜研究，得到9個(gè)共有色譜峰，將至靈膠囊9號(hào)作為參比峰，其他色譜峰相對(duì)于至靈膠囊9號(hào)峰的峰面積量化，得到原始數(shù)據(jù)作為聚類分析的指標(biāo)，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，聚類分析圖見(jiàn)圖4。從圖4可以看出S1、S2為一類，為百令膠囊，S3、S4為一類，為寧心寶膠囊，S5、S6、S7為一類，為至靈膠囊，S8、S9為一類，為心肝寶膠囊，S10、S11、S12為一類，為金水寶膠囊。這與實(shí)際情況相符合，說(shuō)明該方法可以很好的鑒別不同種類的蟲(chóng)草菌絲體，可以作為一種蟲(chóng)草菌絲體質(zhì)量控制的手段。

圖2　蟲(chóng)草菌絲HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3　12批樣品峰面積聚類分析圖

3討論

3.1不同提取方式得選擇實(shí)驗(yàn)考察了冷凝回流提取、冷浸提取、超聲波提取三種提取方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取化學(xué)成分多、操作簡(jiǎn)單方便、效率高、因此采用超聲波提取供試品。

3.2不同提取溶劑測(cè)選擇實(shí)驗(yàn)比較了水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、純甲醇作為提取溶劑，結(jié)果表明甲醇作為提取溶劑、所得的峰多，且分離效果較好，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器，對(duì)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉色譜圖在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)260nm，基線最平穩(wěn)，且主要化學(xué)成分峰也最高，因此確定260nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4流動(dòng)相的選擇蟲(chóng)草菌絲類所含化學(xué)成分復(fù)雜，且各種類型的化合物的極性差別較大，考察了等梯度甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、及甲醇-0.05%磷酸水系統(tǒng)、乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度系統(tǒng)，基線最平穩(wěn)，且分離較好，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫。

3.5建立指紋圖譜的意義本實(shí)驗(yàn)建立的蟲(chóng)草菌絲指紋圖譜，能夠使蟲(chóng)草菌絲體共有成分以及各蟲(chóng)草菌絲體特有成分在色譜圖中體現(xiàn)，從而化學(xué)成分的角度反映不同生產(chǎn)廠家蟲(chóng)草菌絲整體化學(xué)信息，因此可作為一種鑒別不同廠家生產(chǎn)的蟲(chóng)草菌絲體方法，所建的指紋圖譜具有良好的穩(wěn)定性和可控性，因此也可以作為蟲(chóng)草菌絲產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量控制的一種有效方法。

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HPLC Fingerprint Analysis of Mycelium of Cultured Cordy

NIE He-yun1,CHEN Li-hua1,ZHANG Qing-hua,ZHU Wei-feng1, YANG ming2, GUAN Yong-mei1

1.KeyLaboratoryforModernPreparationofTraditionalChineseMedicine,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiJimingkexinJinshuibaoCo.Ltd,Nanchang330096,China.

Abstract:Objective：To establish HPLC fingerprints of mycelium of cuhured cordy for qualitycontrol.Method:HPLC method was used for the determination of phenomenx.OOG-4435-EO-C18column(250mm×4.6mm,5μm)and methanol-0.05%H3PO4in gradient ehtion as a mobile phase，the detection wavelength was 260nm，injection sample of 10μL and flow rate of 1.0mL/min；The similarity of fingerprints was evaluated，then，duster analysis was studied.Result: HPLC fingerprint of cordyceps Mycelial was established，nine common peaks were selected as the fingerprint peaks of cordyceps Mycelial；The relative retention time and the ranges of relative area of the common peaks were determined，cordyceps Mycelial from different production of producers and could be distinguished by the HPLC fingerprint.Conclusion:The method has desirable precision，reproducibility and stability，it can be applied to the quality control of cordyceps Mycelial.

Key words:Cordyceps Mycelial；HPLC；Fingerprint；Similarity

收稿日期：(2015-05-14)編輯：翟興英

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

通信作者：***管詠梅，女，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。Tel:0791-87118614，E-mail: guanym2008@163.com。