當藥苦苷體內向香豆素類化合物轉化過程的研究

★　李勝　(鷹潭市人民醫院藥劑科　江西 鷹潭335000)

當藥苦苷體內向香豆素類化合物轉化過程的研究

★李勝(鷹潭市人民醫院藥劑科江西 鷹潭335000)

摘要：目的：探究當藥苦苷體內向香豆素類化合物轉化的過程。方法：通過設計化學衍生化-LC/MS的方法對可能代謝物進行檢測，當藥苦苷的體外主要的代謝產物為紅百金花內酯，于是采用衍生化的方法提高其檢測靈敏度。再經過動物實驗和肝微粒孵育進行驗證。結果：樣品處理后經LC/MS經色譜測定后，專屬性、精密度和準確度、穩定性等均滿足生物樣品分析，大鼠血漿中ECR定量分析，平均最高血藥濃度、最長吸收時間、最大藥時曲線面積分別為425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min。結論：大鼠灌胃當藥苦苷后血漿經衍生化，成功在血漿中檢測到了紅百金花內酯，當藥苦苷首先在體內被水解變成苷元，大部分苷元經重排變成紅百金花內酯，一個二氫香豆素，首次闡明了當藥苦苷的大鼠體內代謝產物，發現其可以由單萜類化合物轉化為生物堿類和香豆素類化合物，并以代謝物的形式發揮藥效。豐富了環烯醚萜類化合物的體內代謝研究方法。

關鍵詞：當藥苦苷；香豆素；化學衍生化

當藥苦苷是獐芽菜屬植物中分布最廣、含量最高的裂環烯醚萜氧糖苷類成分之一。相關研究[1-2]表明當藥苦苷具有清肝利膽、解痙鎮痛、降低血脂和消炎抑菌等藥理作用，由于其具有較強的生物活性且擁有豐富的資源，具備深入研究開發的潛力，主要轉化產物是紅百金花內酯，為探索該代謝物的存在，本文采用衍生化-LC/MS的方法進行觀察，并通過動物實驗和肝微粒孵育進行驗證。

1材料

1.1試藥當藥苦苷(純度>98%)、紅百金花內酯(純度>98%)。DNPH(2,4-二硝基苯肼)，內標MFB(4-甲酰苯甲酸甲酯)購于sigma 公司。色譜級乙腈購于德國Merck公司。色譜甲醇購自美國Fisher公司。去離子水購自廣州屈臣氏。Wistar 大鼠(250±10)g(黑龍江中醫藥大學動物實驗中心)。

1.2儀器Agilent 1200超高效液相色譜(美國Agilent公司);色譜柱采用Hypersil GOLD C18 色譜柱(50mm×2.1mm 粒徑1.9μm)(Thermo Fisher Scientific,Waltham ,MA);柱溫30℃;進樣量為5ΜL;流動相A為1%甲酸和水，流動相B為1%甲酸和乙腈，流速0.4mL/min 。洗脫程序如下：0min 20%B, 2.5 min, 40% B; 4 min, 99% B；5 min 20% B,最后平衡1min，總時間為6min.質譜檢測條件：Agilent 6520質譜(美國安捷倫公司),毛細管電壓4000V，裂解電壓100V， 噴霧壓力 45 psi，干燥氣體(N2)流速9L/min， 干燥氣體溫度330℃，檢測范圍100-1000Da.檢測離子:伯醇衍生物m/z 355.0684[M+H]+,內標物衍生物m/z 343.0684[M+H]+。

2方法和結果

2.1樣品處理在進行大鼠血漿中紅百金花內酯衍生化-LC/MS方法的建立與大鼠灌胃給藥后，(1)紅百金花內酯體外衍生化過程，分別向500μL 2.273mmol/L ECR 乙腈溶液，和500μL 1.22 mmol/L MFBC 乙腈溶液。混合后的溶液37℃放置1h。3mL乙酸乙酯：正己烷(1:5)加入到混合溶液中，渦旋，室溫靜置分層。上層溶液25℃ N2吹干，殘渣500μL甲醇復溶，LC-ESI-MS分析。(2)給藥后的大鼠血漿樣品衍生化200mg/kg當藥苦苷水溶液灌胃給大鼠,0.17,0.33,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36 和48h采血。200μL血漿中加入600μL乙腈，渦旋30s，4℃ 12000rpm離心10min，留上層溶液。取500μL上清液加入到EP管中，進行衍生化。方法同紅百金花內酯體外衍生化。(3)標準溶液的配置精密稱取一定量的ECR,MFBC(IS)用乙腈溶解，并各自稀釋成1mg/mL和10mg/mL的工作液。4℃環境保存。(4)標準曲線的制備內標液1μg/mL由稀釋原始工作液得來。取空白大鼠血漿90μL于1.5mL塑料離心管中，依次加入不同濃度的ECR標準溶液10μL，內標標準液10μL,配置成藥物濃度范圍在0.5-500ng/mL(1, 25, 250ng/mL)的標準溶液。記為高濃度、中濃度、低濃度QC。

2.2法學考察

2.2.1精密度試驗取空白物質基質，按照標準曲線項下的方法，分別在同一批內和不同批間制備含紅百金花內酯濃度為(1,25,250ng/mL)的質控樣品，并分析測定。

日內精密度：在一個工作日內完成，要求隨行制備一條標準曲線和每一濃度制備5個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標準曲線分別計算3個濃度的變異系數。

2.2.2日間精密度在3個共日內完成，每個工作日完成一個分析批的樣品測定，要求每一分析批內制備一條標準曲線，每個濃度一個樣品，每個樣品測定一次。用隨行標準曲線分別計算3個濃度的變異系數。

2.2.3回收率試驗取空白物質基質，分別制備含紅百金花內酯濃度為1，25,250ng/mL的質控樣品，按照標準曲線項下的方法處理并分析測定，與用流動相所制備的相同濃度樣品衍生化處理比較所得。

2.2.4衍生化過程大鼠灌胃當藥苦苷后血漿經衍生化，成功在血漿中檢測到了紅百金花內酯,見圖1，對大鼠灌胃后的體內紅百金花內酯進行檢測，色譜圖見圖2.

圖1　當藥苦苷體內代謝成紅百金花內酯及其衍生化過程

圖2　血漿中紅白金花內酯色譜檢測

-one 。

2.2.5專屬性樣品處理后經LC/MS經測定在上述色譜系統中，血漿中的內源物質及其他雜質不干擾樣品的測定。各檢測物色譜行為較佳，紅百金花內酯和4-甲氧基苯甲酸甲酯衍生物的保留時間分別為4.6min和5.1min。

2.2.6精密度和準確度本方法中高、中、低三個濃度日內和日間精密度分別<8.13,<6.19,準確度在0.86%-5.13%之內?；厥章?2.2%-70.8%。滿足生物樣品分析的要求,見表1 。

2.2.7穩定性考察不同實驗條件下，測定室溫放置一段時間后的大鼠血漿中紅百金花內酯的濃度，以及-20℃放置3天后伯醇衍生產物的穩定性，結果如表2。在進樣瓶中放置16h，-20℃放置3天，溶液濃度無明顯變化,說明穩定性良好。

表1紅百金花內酯衍生物在大鼠血漿中的日內精密度和日間精密度

樣品濃度/ng·mL-1日內(n=5)CV/%RE/%日間(n=15)CV/%RE/%11.06±0.074.514.581.09±0.105.964.662525.59±0.773.362.6126.21±0.734.522.55250261.28±71.237.534.20261.52±56.245.303.54

表2　紅百金花內酯和其衍生物的穩定性

2.2.8大血漿中ECR定量分析二硝基苯肼衍生化成功用于紅百金花內酯血藥濃度的測定。大鼠灌胃給藥當藥苦苷水溶液200mg/kg后，根據藥時曲線平均最高血藥濃度，最長吸收時間，最大藥時曲線面積分別為425.8±127.6ng/mL,128.6min ,38.8μg/mL·min。

3討論

當藥苦苷大鼠灌胃后，血漿用羰基試劑處理，得到了與羰基試劑結合的紅白金花內酯衍生物。推斷可能是紅白金花內酯與血中白蛋白發生共價結合[3]，羰基試劑把其置換，產生的衍生化產物具有很高的質譜檢測靈敏度，于是被檢測到。以上對新代謝物的合成，從化學角度對其結構進行了準確無誤的確認，也為其活性測試做好了物質準備，當藥苦苷首先在體內被水解變成苷元，大部分苷元經重排變成紅百金花內酯，一個二氫香豆素，紅百金花內酯在肝臟中被進一步代謝成終產物3,4-dihydro-5-(hydroxymethyl) isochroman-1-one的硫酸結合物，并被排出體外。即環烯醚萜化合物當藥苦苷在體內最終被代謝成含氮化合物及香豆素。本研究對當藥苦苷的體內代謝過程進行了研究,闡明了當藥苦苷的大鼠體內代謝產物，發現其可以由單萜類化合物轉化為生物堿類和香豆素類化合物，并以代謝物的形式發揮藥效。

參考文獻

[1]李林虎,陳莉,夏玉鳳. 抗腫瘤香豆素類化合物的研究進展[J].中國藥科大學學報,2013,44(4):374-379.

[2]夏令先,王玉斌,黃文龍,等. 香豆素類化合物的抗腫瘤作用研究進展[J].中國新藥雜志,2013,22(20):2392-2404.

[3]步達,姚曉,鄭紫婷,等. HPLC法測定明黨參組織培養物和栽培品中香豆素成分的含量[J].天然產物研究與開發,2014,26(10):1638-1643.

Study on the Transformation Process of Swertiamain in Medicine to Coumarins

LI Sheng

People'sHospitalofYingtan,PharmacyDepartment，Yingtan335000,China.

Abstract:Objective: To explore the process of medicine of swertiamarin in vivo transformation to coumarins. Methods: Through the design of chemical derivative method -LC/MS of metabolites were detected, Swertia bitter glycosides in vitro primary metabolites as erythrocentaurin, so the use of derivative of the methods to improve the detection sensitivity. The animal experiment and the liver microsomal incubation were carried out to verify the. Results: The specificity, precision, accuracy and stability of the samples were analyzed by LC/MS, and the average blood concentration, the maximum absorption time and the maximum drug curve were 425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min respectively. Conclusion: Rat irrigation stomach Swertia bitter glycosides by plasma via deriving biochemical, success in the plasma detected erythrocentaurin, Swertia bitter glycoside first in vivo was hydrolyzed into aglycones. Most of the aglycone by rearrangement into erythrocentaurin, a Dihydrocoumarin first clarify Swertia bitter glycosides of rats in vivo metabolites, found that it can into the monoterpene compounds of alkaloids, coumarins, and its metabolites in the form of play a pharmacodynamics. Study on the metabolism of the compounds in the body of the cyclic ethers.

Key words:Swertia Gentiopicroside;Coumarin;Chemical Derivatization

收稿日期：(2015-05-14)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A