人參皂甙單體Rb1對大鼠腦缺血損傷保護作用的實驗研究

任慶華　羅江兵　李長清

529000　廣東省江門市人民醫院神經內科(任慶華),神經外科(羅江兵)；重慶醫科大學附屬第二醫院神經內科(李長清)

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人參皂甙單體Rb1對大鼠腦缺血損傷保護作用的實驗研究

任慶華羅江兵李長清

529000廣東省江門市人民醫院神經內科(任慶華),神經外科(羅江兵)；重慶醫科大學附屬第二醫院神經內科(李長清)

中樞神經系統損傷后康復是醫學界一大難題，缺血性腦血管疾病則是中樞神經系統損傷的常見原因。人參是傳統中藥，其提取物的多種成分具有藥理活性，其中Rb1可誘導神經元的分化，保護皮質神經元，誘導其突起生長，對中樞神經系統有神經營養效應[1]。本實驗采用人參皂甙單體Rb1對鼠實驗性腦缺血后進行干預，觀察其可能的腦保護效應。

1材料與方法

1.1動物成年雄性清潔級SD大鼠30只(由重慶醫科大學動物實驗中心提供)隨機分為5組, 假手術組(Sham)、缺血對照組(Con)、干預組(Tre)，干預組又分為Rb130 mg/kg、60 mg/kg及90 mg/kg三個不同劑量組，每組各6只。采用Zea Longa改良法建立大腦中動脈閉塞(MCAO)模型[2]。干預組在術前用相應劑量Rb1 ip qd×7 d，末次給藥后3 h內造模，假手術組與缺血對照組術前用相同劑量生理鹽水代替；假手術組接受手術，但栓線不插入頸內動脈顱內段。對照組及干預組大鼠清醒后無神經功能缺損者或有蛛網膜下腔出血者棄之，隨機補充大鼠。

1.2標本采集術后48 h再次麻醉大鼠，直視下開胸，剪開右心耳，以200 ml生理鹽水經升主動脈快速灌注，然后以4%多聚甲醛400 ml灌注；灌注完畢后立即斷頭取腦，于中1/3處取冠狀位切片(厚約3～4 mm)，4%多聚甲醛中固定過夜常規石蠟包埋；用于TTC染色或腦組織含水量測定的標本在麻醉后直接快速斷頭取腦，不做灌注處理。

1.3神經功能缺失征象的評定采用Zea Longa評分[2]，0分：無神經功能缺損，肢體活動正常：1分：神經功能輕度局灶性損傷,提尾時不能伸展左前肢；2分：神經功能中度局灶性損傷，向左側劃圈；3分：神經功能重度局灶性損傷，向左側傾倒；4分：神經功能極重度局灶性損傷,無自主行走、意識障礙或昏迷。

1.4病理學觀察及調亡細胞檢測石蠟切片常規HE染色觀察缺血后病理改變。原位末端標記DNA片段(TUNEL)檢測細胞凋亡。調亡試劑盒由德國Roche公司提供，操作過程按說明書進行。

1.5TTC染色測定梗死面積取大鼠新鮮腦組織，從額極至小腦做冠狀位切片，每片厚2 mm；將腦片浸入37 ℃預熱的2%TTC溶液中37 ℃中孵育15 min，4%的中性多聚甲醛10 ml固定24 h，數碼像機攝像,在TD2000計算機圖像分析系統上計算出梗死區相對體積。水腫對梗死灶體積的影響采用Swanson的方法進行糾正，即梗死面積=非缺血側半球面積-缺血側半球未梗死區面積，梗死灶體積以梗死側體積和非缺血側半球體積的百分比(%)來表示[3]。

1.6腦含水量(BWC)測定(干濕重法)新鮮腦組織放在一個內有生理鹽水潤濕的定性濾紙的培養皿中，以防水分蒸發，去除皮質表面的軟腦膜、小腦、腦干；取缺血側和梗死對側大腦半球分別置于稱量杯中分析天平稱濕重；從取腦到稱量完畢時間控制在5 min，然后放入電熱恒溫箱內100 ℃烘烤24 h后取出，至分析天平恒重后稱干重(兩次干重之差小于等于0.2 mg)；腦組織含水量按以下公式計算：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重× 100%[4]。

1.7NgR表達的測定石蠟切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10～15 min，置于0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中進行微波抗原修復，冷卻至室溫后0.01 M的PBS浸泡5 min，滴加正常山羊封閉血清室溫孵育20 min，傾去多余血清，滴加抗NgR(純化的抗Nogo-66受體的IgG抗體，美國ad公司，按1∶150的比例稀釋)30 ul4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標記的二抗工作液，室溫孵育15 min，滴加辣根標記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，DAB顯色，鏡下觀察控制染色時間，自來水充分沖洗；蘇木素復染，鏡下觀察控制染色時間，自來水充分沖洗；脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。各步驟間均用0.01 M PBS充分沖洗。同時設立對照，用正常羊血清代替抗NgR。二抗試劑盒為中山試劑公司提供的SP-9001。在計算機上用TD2000病理圖像分析系統分析并計算陽性表達面積(μm2)。

2結果

2.1大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經功能評分、腦梗死體積及腦組織含水量的變化。

在缺血后48 h缺血對照組表現出不同程度神經功能缺失，出現梗死病灶及腦水腫。各干預組與假手術組或缺血對照組相比差異顯著。在神經功能評分中干預組相鄰劑量組間比較無顯著差異(P>0.05)，干預各組間腦梗死體積及腦組織含水量比較(P<0.05)(表1)。

2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織病理學觀察

缺血后48 h腦組織出現不同程度的腦水腫及神經細胞缺失，失去正常結構形態，細胞變形，核固縮，細胞周圍出現空泡，可見紅色神經元。缺血對照組的病理改變明顯重于干預各組，出現神經細胞潰變，神經纖維網疏松呈海綿狀。

表1　各組大鼠神經功能評分、腦梗死體積

注：One-way ANOVA，與缺血對照組比較，△P>0.05，*P<0.05，▲P<0.01；與假手術組比較，▽P<0.01

2.3大鼠局灶性腦缺血再灌注后調亡細胞及NgR表達的變化。

表2　各組大鼠調亡細胞數及NgR表達的變化

注：與缺血對照組比較，*P<0.01；△P>0.05

TUNEL法檢測調亡細胞，DAB顯色，蘇木素復染，陽性表現為核固縮深染的棕黃色細胞為調亡細胞。在假手術組腦組織偶見調亡細胞。缺血后調亡細胞增加，各干預組增加程度較缺血對照組小(P<0.01)。各干預組間比較(P<0.05)(表2)。

NgR主要表達在細胞膜及突起上，呈棕黃色。在假手術組也有表達，主要在胞膜上，突起上表達少；缺血后表達增多，表現為表達強度增加及突起上表達增加，突起上表達主要在近端。各組間均有顯著差異。(圖1～5)

3討論

腦梗死是臨床多發病，發病后腦水腫程度、梗死面積大小、神經細胞存活情況等嚴重影響著病人的功能恢復及預后。本實驗觀察到病理檢查顯示假手術組形態結構基本正常，大腦皮質分層清楚。缺血后48 h腦組織出現不同程度的腦水腫及神經細胞缺失，失去正常結構形態，細胞變形，核固縮，細胞周圍出現空泡，可見紅色神經元。缺血對照組的病理改變明顯重于干預各組，出現神經細胞潰變，神經纖維網疏松呈海綿狀。干預組的間質水腫明顯輕于缺血對照組。腦組織受到缺血缺氧刺激，誘發神經細胞死亡。細胞在形態學上有兩種死亡過程：一種是有害因素的極度刺激造成的病理性死亡，即壞死；另一種是細胞內外因素激活細胞本身的主動程序性死亡，即凋亡，主要表現為染色質凝集，胞膜完整，細胞內容物不釋放，不引起炎癥反應。近年來對調亡機制的研究顯示腦缺血后神經細胞死亡與細胞調亡關系密切。TUNEL法利用分子生物學與組織化學相結合的技術，特異性標記DNA片段，原位檢測凋亡細胞,并具有較高的敏感性。如何有效控制腦水腫，防止梗塞體積擴大，保護存活細胞挽救瀕死細胞將有重要的臨床意義。本實驗顯示干預組預先給人參皂甙單體Rb1能夠顯著減少腦水腫程度、減小梗死面積及梗塞周邊區調亡細胞，改善功能評分，這與病理改變一致。不同劑量組間顯示出不同的保護強度。提示Rb1能通過減輕缺血性損傷后腦水腫等作用發揮神經保護作用且具有劑量依賴性。

圖1 假手術組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達水平(×200倍) 圖2 缺血對照組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達水平(×200倍) 圖3 Rb130mg/kg組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達水平(×200倍) 圖4 Rb160mg/kg組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達水平(×200倍) 圖5 Rb190mg/kg大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達水平(×200倍)

中樞神經系統(CNS)損傷后的再生能力一直是神經病學家高度關注的問題，這是影響功能恢復的關鍵。同發育中的CNS相比，成熟CNS損傷后的功能恢復及結構可塑性能力是很有限的。現有研究顯示眾多抑制因子中Nogo-A備受注目，它分布于CNS髓鞘膜中，有兩個活性區域。其中Nogo-66與NgR(Nogo-66 receptor)特異性結合而表現出強大的抑制軸突生長的作用[5]。用Nogo-66的特異競爭性拮抗劑NEP1-40阻止Nogo-66與NgR的結合，可以促進損傷軸突生長及功能恢復[6]。已在鼠短暫性半球缺血(缺血10分鐘)后檢測到NgR的表達增高[7]。已有研究顯示NgR不僅僅是Nogo-A的作用點，它還是其它中樞髓鞘衍生軸突生長抑制因子髓鞘相關糖蛋白(MAG)和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(OMgp)發揮作用的集中點[8-9]，對NgR進行干預或許可以收到比干預單一抑制因子更強大的促軸突生長作用。本實驗觀察到實驗性腦梗死后NgR的表達增高，表現為表達強度增加及突起上表達增加。干預組的增高程度低于缺血對照組，有顯著差異。這提示Rb1可能在中樞神經系統損傷后康復中起促進作用。但其作用是直接干預NgR的表達，還是存在其它環節的作用？有待實驗進一步研究。

人參是傳統醫藥的重要藥材，Rb1是從中提取的有效單體之一，有著多方面的藥理作用[10-12]。本實驗結果顯示其提取物Rb1對鼠實驗性腦缺血再灌注損傷有保護作用且呈劑量相關性，這不僅為臨床用藥提供依據，還為臨床治療中樞神經損傷開辟新思路。

參考文獻

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11羅天飛，劉姍姍，葛鵬飛，等.人參皂甙Rbl對短暫腦缺血后神經元損傷的保護作用.中國老年學雜志，2008，10(28)：1892-1984.

(2014-09-18收稿)

【摘要】目的觀察人參皂甙單體Rb1 對大鼠實驗性腦缺血的保護作用。方法健康成年雄性清潔級SD大鼠隨機分為假手術組(Sham)、缺血對照組(Con)、干預組(Tre)，干預組又分為Rb130 mg/kg、60 mg/kg及90 mg/kg三個不同劑量組。缺血對照組采用線栓法建立大腦中動脈閉塞模型，缺血2 h后撥出線栓再灌注；各干預組用相應劑量Rb1 ip qd×7 d，末次給藥后3 h內用同樣方法建立大腦中動脈閉塞模型及再灌注；假手術組不插入線栓，余操作相同。術后48 h取標本TTC染色測梗死體積、干濕重法腦組織含水量測定、Tunnel法測定調亡細胞數及NgR表達的免疫組化測定。結果各干預組的梗死體積分別為30 mg/kg組(27.629±1.401)%，60 mg/kg組(24.164±1.710)%，90mg/kg組(21.955±2.556)%，缺血對照組為(29.846±1.153)%；腦組織含水量為30 mg/kg組(80.079±0.726)%，60 mg/kg組(78.984±0.902)%，90 mg/kg組(77.855±0.258)%，假手術組與缺血對照組分別為(76.517±0.37)%、(81.799±1.065)%；調亡細胞數分別為30 mg/kg組(89.000±10.296)，60 mg/kg組(59.000±12.522)，90 mg/kg組(36.667±19.054)，假手術組與缺血對照組分別為(1.600±1.517)、(132.667±22.223)；NgR表達陽性面積分別為30 mg/kg組(84.827±3.870)，90 mg/kg組(66.040±5.541)，60 mg/kg組(75.577±7.150)，假手術組與缺血對照組分別為(48.355±9.720)、(91.485±5.822)。結論人參皂甙單體Rb1對大鼠實驗性腦缺血有保護作用，能減輕缺血再灌注損傷所致的腦水腫及梗塞面積，減少細胞調亡，并且該保護作用呈劑量依賴性。對NgR表達的干預提示Rb1可能在腦缺血死后神經可塑性中起促進作用。

【關鍵詞】腦缺血人參皂甙再灌注損傷Rb1NgR

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.003

Experimental study on the protection of ginseng Rb1 in rats with cerebral ischemic reperfusion injuryRenQinghua,LuoJiangbing,LiChangqing.DepartmentofNeurology,thePeople’sHospitalofJiangmenCity,GuangdongProvince,Jiangmen529000

【Abstract】ObjectiveTo observe the protection of ginseng Rb1 in rats with local cerebral ischemic reperfusion injury.MethodsHealthy Sprague-Dawley rats were divided into three groups: Sham, control and treat group. Treat group was divided into three subgroups : Rb130 mg/kg、60 mg/kg and 90 mg/kg group. MCAO models were created after seven days of Rb1 ip qd in treat group with respective dose and NS ip qd in control group.Tthe line extracted after occlusion 2 h. Sham group only receives sham operation. Rats were sacrificed at 48 h. The markers such as the expression intensity of NgR protein, brain water content, volume of infarction by TTC staining, and the count of apoptosis cell were estimated.ResultsCompared with control groups, the levels of expression of NgR protein, brain water content, volume of infarction and the count of apoptosis cell were lower in treat group and showed statistical difference (P<0.05). In treat group, there was also statistical difference between three subgroups.ConclusionsThe article show ginseng Rb1 has protective effect on rats with local cerebral ischemic reperfusion injury. Rb1 can decrease brain edema, infarction volume and apoptosis cell counting induced by local ischemic perfusion injury. It also indicates Rb1 may play a role in rehabilitation after CNS injury because Rb1 reduced the expression of NgR protein.

【Key words】Cerebral ischemiaGinsengRb1Reperfusion injuryNgR

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)04-0203-04