大鼠局灶性腦缺血后神經營養因子表達的自然變化

劉　鵬　王　瑾　苗常青　劉　玥　唐　鵬侯　辰　張　欣　種　莉　李曉青　李　銳

710068　西安,陜西省人民醫院老年神經內科[劉　鵬　劉　玥　唐　鵬　侯　辰　張　欣　種　莉　李曉青　李　銳(通信作者)]；西安交通大學醫學院第一附屬醫院神經內科(王　瑾　苗常青)

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大鼠局灶性腦缺血后神經營養因子表達的自然變化

劉鵬王瑾苗常青劉玥唐鵬侯辰張欣種莉李曉青李銳

710068西安,陜西省人民醫院老年神經內科[劉鵬劉玥唐鵬侯辰張欣種莉李曉青李銳(通信作者)]；西安交通大學醫學院第一附屬醫院神經內科(王瑾苗常青)

缺血性腦血管病嚴重危害人類健康，具有較高發病率，較高致殘率，較高復發率的特點[1]。近年來，關于缺血性腦損害過程的研究表明，神經營養因子對于促進缺血灶周圍和對側正常腦組織的神經突起新生和新突觸形成及神經功能重塑等具有明顯促進作用[2]。故在缺血性腦血管病發生時，神經營養因子對缺血半暗帶的保護顯得尤為重要。大量的基礎和臨床研究都嘗試找到一種有效的外源性神經營養因子，那么腦缺血本身會不會刺激大腦產生神經營養因子而產生自身保護呢？本研究通過復制大鼠大腦中動脈閉塞模型，觀察局灶性腦缺血后大鼠神經行為、梗死體積、組織形態及缺血半暗帶神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達水平變化，明確有無這種自身保護機制的存在。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠24 只，5～7 月齡，體重250～310 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，隨機分為2組，每組12只：Ⅰ組(假手術組)；Ⅱ組(腦缺血組)。自由進食，食標準顆粒飼料，飲自來水。

1.2動物模型制作及神經功能評分標準

參照改良的Longa等右側頸內動脈尼龍線線栓法[3]行左側頸內動脈尼龍線線栓法制作動物模型。栓線不予拔出，不制備再灌注模型。假手術組僅不行血管內栓線，余同模型組。造模成功標準：大鼠麻醉清醒后參考Bederson等的方法[4]進行評分(采用雙盲法，即由有相關專業知識的人員在不知大鼠分組的情況下觀察)，即0分為無神經系統癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為爬行時轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自行行走，意識喪失。以1～3分為造模成功入選標準。并于處死大鼠前再次根據此標準觀察并記錄神經功能評分。

1.3試劑

兔抗大鼠NGF、兔抗大鼠BDNF、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、正常山羊血清均由武漢博士德公司提供。

1.4分組處理

各組在術后48 h斷頭取腦。每只大鼠處死前行神經功能評分，然后每組取其中6只用于做氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色，其余6只做腦組織切片HE染色和免疫組織化學染色。

1.5TTC染色、梗死體積計算

麻醉后斷頭處死，取出鼠腦，置于-20 ℃冰箱凍存5 min；取出后放入特制鼠腦槽中，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余部分從額極向后作冠狀位切片，片厚2 mm，共5～6片，每隔2 mm切一片；腦片迅速置于2 %TTC溶液中，避光，37 ℃溫孵30 min后取出腦片，按順序排列，用數碼相機照相并輸入計算機，利用圖象處理軟件AutoCAD分別計算出各個腦片缺血側的總體積和梗死區域的體積，再求出梗死區域占大腦半球總體積的百分比作為梗死體積。

1.6腦組織切片的制作

麻醉后用0.9 %氯化鈉溶液和多聚甲醛進行心臟灌注固定，斷頭取腦。在左側大腦半球距嗅球尖端7～11 mm之間冠狀位切取約5 mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成臘塊，連續切片，片厚5 μm。每只大鼠連續取3張切片, 1張用于HE染色, 2張用于免疫組化染色。

1.7腦組織病理學及NGF、BDNF免疫組化染色

取各組鼠腦切片行常規HE染色及NGF/BDNF免疫組化染色。假手術組應用圖像信號采集與分析系統，光鏡下隨機計數左側大腦皮質5個不重疊視野(×400倍)下NGF、BDNF陽性神經元數并求均數，其余各組分別隨機計數缺血側梗死灶邊緣區5個不重疊視野(×400倍)下NGF、BDNF陽性神經元數并求均數。同時觀察各組腦組織病理學變化。

1.8統計學處理

2結果

2.1各組大鼠神經功能評分

Ⅰ組(假手術組)大鼠行為無異常。Ⅱ組(腦缺血組)大鼠表現出不同程度的運動功能障礙，提鼠尾可見其右前肢收緊貼胸壁，右側肢體肌力下降，爬行時偏向右側打圈，甚至向右側傾倒(表1)。

2.2各組大鼠腦梗死體積的比較見表2，圖1。

表2　各組大鼠腦梗死體積比較±s)

2.3各組大鼠腦組織形態學變化

Ⅰ組(假手術組)：細胞層次清晰，排列緊密，細胞結構、形態正常，神經細胞胞漿、核染色均勻，核仁清楚，核膜完整，間質內未見出血、壞死及水腫；Ⅱ組(腦缺血組)：左側大腦缺血范圍內可見皮質及紋狀體有片狀壞死，少量神經元殘存，細胞排列松散，形態不規則，神經細胞與細胞周圍間質分離，細胞深染固縮，胞漿尼氏體消失，胞核固縮，核仁消失(圖2)。

圖1 各組大鼠腦片TTC染色 Ⅰ組(假手術組)經TTC染色后腦片全紅;Ⅱ組(腦缺血組)大鼠左側額頂葉皮質及紋狀體可見不同程度的白色梗死灶

2.4各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶NGF、BDNF表達水平變化。

NGF和BDNF免疫陽性細胞在大鼠腦內有較廣泛的分布。NGF陽性反應物主要位于胞漿和突起內，均質致密點狀。BDNF陽性反應物亦主要位于胞漿和突起內，在個別細胞內陽性反應物也可位于胞核內。NGF和BDNF陽性反應物均呈棕黃色顆粒。Ⅰ組(假手術組)大腦皮層NGF和BDNF分布如常(圖3～4)。

表3　各組大鼠腦NGF、BDNF陽性神經元數的比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05

圖2 各組大鼠腦切片HE染色 A為Ⅱ組(×100倍,顯示梗死與正常腦組織過渡區域);B為Ⅰ組(×400倍);C為Ⅱ組(×400倍)

圖3 各組大鼠腦NGF免疫組化染色 A為Ⅱ組(×100倍,顯示梗死與正常腦組織過渡區域);B為Ⅰ組(×400倍);C為Ⅱ組(×400倍)

圖4 各組大鼠腦BDNF免疫組化染色 A為Ⅱ組(×100倍,顯示梗死與正常腦組織過渡區域);B為Ⅰ組(×400倍);C為Ⅱ組(×400倍)

Ⅱ組(腦缺血組)大鼠皮層缺血半暗帶NGF和BDNF陽性神經元數高于Ⅰ組(假手術組)(P<0.05)(表3)。

3討論

腦缺血性后腦組織可以啟動內源性保護機制，以降低腦缺血對腦組織的損害，挽留更多的腦功能[5]。本研究發現，單純腦缺血本身可上調缺血半暗帶神經營養因子的表達水平，提示在缺血缺氧情況下腦組織的內源性保護機制可能與其可上調腦內神經營養因子的表達有關。

神經營養因子是調節神經系統發育、成熟和維持神經功能的蛋白質，可以促進缺血灶周圍和對側正常腦組織的神經突起新生和新突觸形成，對神經再塑具有明顯作用。研究表明，腦缺血后腦內多種神經營養因子如NGF、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和BDNF等因子及其受體表達上調對受損神經組織發揮營養、支持、保護和再生等多種效應[6]。

研究發現，在腦缺血時腦組織內NGF、BDNF的表達均有所增加，這可能是缺血性腦損傷的一種內源性保護機制[7]。本實驗結果提示，腦缺血組與假手術組比較，大腦皮層缺血半暗帶NGF、BDNF陽性神經元數顯著增加，有顯著的統計學差異(P<0.05)， 這提示腦缺血本身可以上調腦神經元對NGF、BDNF的表達水平。

總之，本實驗結果證實了腦缺血可以上調腦內神經元對NGF、BDNF的表達水平，從而參與腦缺血的內源性保護機制，但其具體機制仍不清楚。另外，本研究僅觀察了48 h腦缺血且為單純缺血，無再灌注過程，關于延長干預時間后有無更明顯的腦保護作用以及在缺血再灌注過程中有無其他改變，均有待于進一步研究。

參考文獻

1中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010.中華神經科雜志,2010,43(2):146-153.

2Yang JP,Liu HJ,Yang H,et al.Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia. Neurol Sci, 2011,32(3):433-441.

3Longa EZ,Weinstein PR,Carison S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

4Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke，1986, 17(3):472-476.

5Solev IN,Balabanyan VY,Volchek IA,et al.Involvement of BDNF and NGF in the mechanism of neuroprotective effect of human recombinant erythropoietin nanoforms. Bull Exp Biol Med, 2013,155(2):242-244.

6Autry AE, Monteggia LM.Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders. Pharmacol Rev,2012,64(2): 238-258.

7劉明,劉洋,張易,等.梓醇上調NGF、BDNF及mRNA表達伴隨缺血性腦卒中大鼠神經功能恢復.中華中醫藥雜志, 2011,26(5):977-981.

(2014-12-24收稿)

【摘要】目的觀察大鼠局灶性腦缺血后大鼠神經行為、梗死體積、組織形態及缺血半暗帶神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)的表達水平變化。方法將健康雄性SD大鼠24只隨機分為2組，Ⅰ組(假手術組)；Ⅱ組(腦缺血組)。用線栓法建立動物模型，不給予再灌注，各組在術后48h斷頭取腦，處死前行神經功能評分，用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色計算腦梗死體積，用HE染色觀察組織學形態，用免疫組織化學染色觀察NGF、BDNF的表達水平。結果Ⅰ組在神經功能評分、梗死體積、組織形態及大腦皮層相應部位NGF、BDNF陽性細胞數均正常。與Ⅰ組比較，Ⅱ組的神經功能評分和梗死體積均嚴重受損；光鏡下Ⅱ組缺血性病理改變較重，與Ⅰ組比較，Ⅱ組缺血半暗帶NGF、BDNF陽性神經元數增加(P<0.05)。結論腦缺血本身可上調缺血半暗帶NGF、BDNF的表達水平。

【關鍵詞】腦缺血神經生長因子腦源性神經營養因子

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.005

Expression of neurotropic factors after focal cerebral ischemia injury in rats.LiuPeng,WangJin,MiaoChangqing,etal.DepartmentofGeriatricNeurology,theShanxiProvincialPeople’sHospital,Xian710068

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of neurotropic factors on a rat model of focal middle cerebral artery occlusion (MCAO).MethodsTwenty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups, groupⅠ(Sham operated rats) and groupⅡ(MCAO ischemia). The neuroethology assessment was evaluated at 48h before the rats were executed and given reperfusion. The volume of cerebral infarction and the pathologic changes were observed by TTC staining and HE staining. The expression of NGF and BDNF was tested by immunohistochemistry.ResultsUnder optical microscope, group Ⅱhad more degree of cerebral ischemic injury in pathomorphology. The numbers of NGF and BDNF immunopositive neurons in ischemic penumbra of groupⅡ were higher than those in cerebral cortex of groupⅠ (P <0.05).ConclusionsBrain ischemia injury can increase the expression NGF and BDNF in the brain ischemic penumbra, bur its mechanism is not clear.

【Key words】Cerebral ischemia injuryNerve growth factorBrain-derived neurotrophic factor

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)04-0211-04

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2013JM4020)