鹽酸法舒地爾對慢性腦低灌注損傷大鼠海馬細胞的保護作用

孫　莉　梅　瑰　郭蓮軍　陳玉華

430010　武漢，長江航運總醫院 武漢腦科醫院[孫　莉　梅　瑰　陳玉華(通信作者)]；華中科技大學同濟醫學院藥理系(郭蓮軍)

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鹽酸法舒地爾對慢性腦低灌注損傷大鼠海馬細胞的保護作用

孫莉梅瑰郭蓮軍陳玉華

430010武漢，長江航運總醫院 武漢腦科醫院[孫莉梅瑰陳玉華(通信作者)]；華中科技大學同濟醫學院藥理系(郭蓮軍)

鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil, HF)，其化學結構為6(H)-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1，4-二氮雜卓鹽酸鹽[1]，作為一種擴血管藥物首次在日本上市，主要應用于改善及預防蛛網膜下腔出血術后的腦血管痙攣及隨之引起的腦缺血癥狀，一種Rho激酶特異性抑制劑，通過抑制Rho激酶舒張血管增加腦供血并抑制炎癥反應[2]，上調eNOS蛋白表達[3]改善血管內皮功能，稀釋血液降低血液粘滯度[4]，并抑制中性粒細胞的遷移[5]。慢性腦缺血致認知功能障礙是臨床上常見的腦損傷之一，已成為研究的熱點，其損傷機制尚未闡明。鹽酸法舒地爾不僅可以通過抑制Rho激酶來緩解腦缺血癥狀，還可以通過直接作用于受損神經元而發揮神經保護作用[6-7]。海馬是參與學習與記憶功能的重要腦區，本研究應用水迷宮實驗及HE染色觀察慢性腦缺血后及經鹽酸法舒地爾治療30 d后對大鼠學習記憶功能的影響及海馬細胞形態的變化，從而探討鹽酸法舒地爾改善慢性腦缺血致認知功能障礙的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級，體重180～220 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供(動物證號：No19-050)。大鼠隨機分籠飼養，維持室溫20～22 ℃，自由攝食與飲水，自然光照節律，每天提供足量的食物和水。

1.2主要藥品和試劑

鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil，HF)，白色粉劑，純度>98%，Tocris Cookson Ltd. (Britol, UK)公司生產，批號040311，臨用前用生理鹽水溶解并稀釋至所需濃度，注意避光。其余藥品和試劑均為市售分析純。

1.3動物模型制備

大鼠慢性不完全性全腦缺血模型采用大鼠雙側頸總動脈永久性結扎(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)制備。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔內注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛，強力碘消毒，頸部正中切口，分離雙側頸總動脈，并套以“0”號線，分別結扎雙側頸總動脈的近心端和遠心端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流；縫合后腹腔注射生理鹽水4～5 mL，放回籠中飼養。假手術組除不結扎、不剪斷雙側頸總動脈外，其余過程與模型組相同。術中保持大鼠肛溫36.5～37.5 ℃。各組大鼠同條件飼養，在相同時間點作各種檢測。

1.4實驗分組與給藥

將Sprague-Dawley大鼠隨機分為3組，即(1)假手術組；(2)腦缺血模型組：永久性結扎雙側頸總動脈(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)；(3)HF治療組：2VO + HF 10 mg/kg。2VO術后第1 d開始腹腔注射給藥，假手術組和腦缺血模型組分別給予等體積的生理鹽水；HF治療組給予鹽酸法舒地爾10 mg/kg，1次/d，持續30 d。

1.5大鼠空間學習和記憶能力檢測

大鼠雙側頸總動脈結扎30 d后用Morris水迷宮實驗方法檢測學習記憶能力；實驗裝置為一直徑為200 cm，高50 cm的不銹鋼的圓柱形水池，等分為4個象限；將一直徑約為10 cm的平臺固定于其中某一象限正中心的位置；水深約為30 cm，平臺隱沒在水平面下1.5 cm，水中加入奶粉，使水成為不透明的乳白色，以致看不見平臺位置。測試程序包括(1)定位航行實驗：大鼠連續訓練5 d，每天分上、下午兩個時段，每個時段訓練4次。每次實驗大鼠在4個不同象限中點頭朝池壁放入水池，次序每天不同，任其游泳，直至找到平臺；大鼠找到平臺時間和軌跡由水池上方的攝像機記錄；180 s內到達平臺的時間即逃避潛伏期，4個象限記錄的時間的平均值作為當天大鼠的逃逸潛伏期；(2)空間探索實驗：實驗第6 d，撤除平臺，記錄大鼠在180 s內大鼠在目標象限的停留時間；采用MT-200水迷宮圖像追蹤系統監測大鼠游泳軌跡；水迷宮實驗在每天早上10:30～12:00進行。

1.6組織學觀察

大鼠水迷宮實驗結束后腹腔注射20%烏拉坦0.6 mL/100 g麻醉，于30～40 min內從左心室快速灌注生理鹽水100～150 mL，繼續灌注4%多聚甲醛500 mL；大鼠靜置于4 ℃冰箱，3 h后取出大腦，置4 ℃的同樣的固定液中過夜，經梯度酒精(濃度依次為80%、95%、100%)上行脫水、二甲苯透明后石蠟包埋；自前囟后2.0 cm處以5 um的厚度行連續冠狀位切片；石蠟切片經二甲苯脫蠟透明、梯度酒精(濃度依次為100%，95%)下行至水后PBS漂洗2次，每次5 min；加入蘇木素染色5 min后自來水沖洗10 min，1%鹽酸水溶液分色，自來水沖洗10 min，伊紅染色5 min；切片經酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片；普通光學顯微鏡下觀察皮層、海馬細胞形態變化。

1.7在體電生理記錄

各組大鼠水迷宮實驗結束后烏拉坦(1.5 g/kg, ip)麻醉，用恒溫水循環系統維持大鼠體溫至37 ℃；頭部固定于腦立體定位儀(SN-3, 5 Narishige, Japan)，在無菌條件下剪開皮膚和筋膜暴露頭骨，刺激電極插入海馬Schaffer 側枝(前囟后3.5～4.0 mm；中縫旁3.1～3.5 mm；硬膜下2.2～2.5 mm)；記錄電極分別定位于同側海馬CA1(前囟后3.2～3.6 mm；中縫旁2.2～2.5 mm；硬膜下1.8～2.2 mm)，電極定位完畢后休息30 min；開始實驗，刺激持續時間0.15 ms，刺激頻率30 Hz，刺激強度為5～30 V；測定每個時間點的群峰電位(population spike, PS)幅度，以刺激前基線記錄的PS平均幅度為100%進行標準化；用RM6240BD 生物信號記錄系統記錄、放大、監測和分析生物信號。

1.8統計學處理

所有計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，運用one/two-way ANOVA分析組間差異，P<0.05表示顯著性差異。

2結果

2.1鹽酸法舒地爾對大鼠慢性腦缺血所致空間學習記憶能力減退的影響

水迷宮實驗發現，模型組大鼠尋找平臺時間即逃避潛伏期與假手術組比較，明顯延長，腦缺血模型組與假手術組比較逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；鹽酸法舒地爾治療組大鼠逃避潛伏期與腦缺血模型組比較有顯著縮短(P<0.05)(圖1)。

空間探索實驗發現，腦缺血模型組大鼠在原來平臺所在象限停留時間與假手術組比較明顯縮短(P<0.05)，腦缺血鹽酸法舒地爾治療組顯著延長大鼠在靶象限中的停留時間(P<0.05)(圖2)。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期隨時間變化 與假手術組比較,#P<0.05;與腦缺血模型組比較,*P<0.05

圖2 各組大鼠在原平臺所在象限探索時間 與假手術組比較,*P<0.05,與腦缺血模型組比較,#P<0.05

2.2鹽酸法舒地爾對2VO大鼠海馬神經元細胞丟失的影響

組織學觀察顯示，光鏡下假手術組海馬神經元結構清晰完整，無異常改變；慢性腦缺血30 d后可見細胞結構較紊亂，神經元丟失；經鹽酸法舒地爾治療30 d后神經元丟失現象減少，明顯優于模型組(圖3～4)。

圖3 各組大鼠海馬組織形態學變化(HE染色×200倍) A為假手術組;B為腦缺血模型組;C為HF治療組

圖4 各組大鼠海馬CAI區存活細胞百分率 與假手術組比較,*P<0.05;與腦缺血模型組比較,#P<0.05

2.3鹽酸法舒地爾對慢性腦低灌大鼠海馬突觸傳遞功能的影響

在體電生理實驗發現，假手術組、腦缺血模型組、HF治療組大鼠強直刺激海馬CA1區PS幅值變化百分率，模型組大鼠PS幅值明顯被抑制，其PS相對幅值均顯著低于假手術組組(P<0.05)，HF治療組大鼠PS幅值明顯改善，顯著高于模型組(P<0.05)(圖5)。

圖5 鹽酸法舒地爾對慢性腦低灌大鼠海馬CA1群峰電位幅度的影響 模型組與假手術組比較,*P<0.05;與腦缺血模型組比較,#P<0.05

3討論

腦組織缺血后神經細胞的損傷有許多病理生理過程參與，目前認為興奮性氨基酸釋放、神經細胞鈣離子超載、氧自由基產生、炎癥反應、細胞凋亡等因素均參與了腦缺血所致的神經細胞損傷的發生與發展[8-9]。腦缺血時細胞內鈣離子超載可以引起Rho激酶的活化，與腦血管痙攣有密切關系。隨著國際上實驗研究的進展，越來越多的研究證實Rho激酶不僅與血管痙攣有關，與腦缺血后神經元細胞的氧化應激損傷亦密切相關[10]。Rho激酶在腦缺血神經元損傷的病理生理過程中占有重要地位,可以改變蛋白的磷酸化過程并影響基因組表達和蛋白合成，從而參與谷氨酸的神經毒性作用以及促進炎癥/氧化應激，進一步引起神經元的磷脂膜、細胞骨架蛋白、核酸等重要結構的解體，導致腦神經信息發生紊亂，能量代謝功能障礙，進而出現神經元缺血性變性、凋亡和壞死，這是血管性認知障礙及癡呆發生機制之一[11-12]。有研究發現，抑制Rho激酶對于海馬的缺血性損傷有重要治療意義[13]。

本實驗通過應用永久性結扎雙側頸總動脈方法制作慢性低灌性大腦缺血模型，觀察Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對大鼠腦缺血后海馬細胞的保護作用。大鼠雙側頸總動脈永久性結扎致慢性大腦缺血30 d后，水迷宮行為學檢測顯示，模型組大鼠逃離潛伏期延長、在目標象限中游泳時間縮短，提示其學習記憶功能明顯受損；海馬組織病理切片可見慢性腦低灌注缺血可導致CA1神經元損傷，表現核深染,細胞丟失，這與相關研究報道一致[10]。給予Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾腹腔注射30 d后腦缺血的SD大鼠學習記憶能力均有明顯改善，并能明顯減輕海馬神經細胞的丟失。提示鹽酸法舒地爾改善大鼠慢性低灌所引起的認知功能障礙與對海馬神經元的保護作用有關。在體電生理實驗顯示，鹽酸法舒地爾可明顯逆轉慢性腦低灌注缺血大鼠CA1群峰電位幅度的降低，表明對海馬突觸傳遞功能損傷有改善作用。

缺血性腦血管疾病的發病機制十分復雜，許多病理生理過程都參與了缺血性腦血管疾病中神經元損傷的發生與損傷級聯反應的發展，鹽酸法舒地爾亦有可能通過其它的途徑改善慢性腦缺血所致的認知功能障礙。詳細作用機制有待深入研究。

參考文獻

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10Rikitake Y, Kim HH, Huang Z, et al.Inhibition of Rho kinase (ROCK) leads to increased cerebral blood flow and stroke protection. Stroke，2005, 36(10):2251-2257.

11Oguro H, Okada K, Yamaguchi S, et al. A six year follow-up study on the influence of silent ischemic brain lesions on cognitve function and brain atrophy in elderly people. Nippon Ronen Igakkai Zasshi,2000, 37(4):298-303.

12Bor nstein NM, Gur AY, Treves TA, et al. Do silent brain infarctions predict the development of dementia after first ischemic stroke?. Stroke, 1996, 27(2-3):904-905.

13Huang L, Li Q, Li H, et al. Inhibition of intracellular Ca2+ release by a Rho-kinase inhibitor for the treatment of ischemic damage in primary cultured rat hippocampal neurons. Eur J Pharmacol, 2009, 602(2-3):238-244.

(2015-04-28收稿)

【摘要】目的觀察Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil, HF)對慢性低灌注腦缺血所致大鼠海馬神經細胞損傷的保護作用。方法采用永久性結扎大鼠雙側頸總動脈(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)制備大鼠慢性不完全性全腦缺血模型，將SD大鼠隨機分為假手術組、腦缺血模型組和HF治療組，運用Morris 水迷宮行為學方法檢測大鼠空間學習記憶能力；用HE染色觀察海馬組織形態學改變。結果Morris 水迷宮檢測發現模型組大鼠學習記憶能力受損，與假手術組比較逃避潛伏期延長、空間辨別能力下降；組織學觀察模型組大鼠海馬CA1細胞發生丟失，組織結構異常。連續給予鹽酸法舒地爾30 d能改善大鼠學習記憶功能，減少腦缺血所致的大鼠海馬神經細胞丟失。結論鹽酸法舒地爾可減少慢性腦缺血所致的大鼠海馬神經元的丟失，改善學習記憶功能。

【關鍵詞】鹽酸法舒地爾Rho激酶腦缺血海馬神經細胞HE染色

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.006

Neuroprotective effects of hydroxy fasudil on brain hippocampal neurons damage of chronic cerebral hypoperfusion rat modelSunLi,MeiGui,GuoLianjun,etal.DepartmentofNeurology,GeneralHospitaloftheYangtzeRiver(WuhanBrainHospital),Wuhan430010

【Abstract】ObjectiveTo observe the neuroprotective effects of hydroxy fasudil (HF), a Rho-kinase inhibitor, on hippocampal neurons damage after chronic cerebral hypoperfusion in a rat model.MethodsChronic cerebral hypoperfusion in rats was performed by permanent occlusion of the bilateral common carotid artery (2VO). SD rats were divided into three groups: sham-operated group, ischemic group and HF treated group (10 mg/kg). Morris water maze was used to measure spatial learning and memory performance. HE stain was used to observe morphology change.ResultsCompare with sham-operation group, 2V0 rats resulted in spatial learning and memory impairments shown by longer escape latency and shorter time spent in the target quadrant. Morphological observe of 2V0 rats hippocampal show CA1 neurons lost. Administration of hydroxy fasudil (10 mg/kg, once per day for 30days) can improve 2V0 rats learning and reduce the neuron lost.ConclusionsLong-term administration of hydroxy fasudil markedly attenuated chronic cerebral hypoperfusion induced neuronal damage.

【Key words】Hydroxy fasudilRho kinaseCerebral ischemiaHippocampal neuronsHE stain

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)04-0215-04

基金項目：交通運輸部長江航務管理局課題(201210011)；武漢市衛計委臨床醫學科研項目(WX14D12)