貴州省3個少數民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態性研究*

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貴州省3個少數民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態性研究*

網絡出版時間：2015-03-19網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0946.011.html

何燕， 趙孝梅， 左婭， 張婷， 鄧婕， 吳昌學， 禹文峰， 官志忠**

(貴陽醫學院 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 了解貴州省3個少數民族(布依族、水族、苗族)群體人類白細胞抗原-G(HLA-G)基因14 bp插入/缺失多態性的分布規律及其與遺傳背景之間的關系。方法： 采用PCR擴增、電泳及測序的方法對來自貴州地區的布依族、水族、苗族共344例健康個體DNA進行HLA-G基因14 bp插入/缺失多態性檢測，并與文獻報道的仡佬族、壯族等13個民族群體的HLA-G基因14 bp插入/缺失多態性分布數據進行對比。結果： 布依族、水族和苗族人群的+14 bp等位基因頻率分別為23.7%、26.0%和38.1%，+14 bp/+14 bp基因型頻率分別為9.40%、10.4%和15.9%，14 bp插入頻率比較示布依族和苗族差異有統計學意義(χ2=11.345，P=0.001)，苗族與水族差異有統計學意義(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族間比較差異無統計學意義(P>0.017)；與其他人群數據比較，苗族群體的14 bp插入/缺失分布與其他人群相似，而作為壯侗語族的布依族、水族則有自己獨特的14 bp插入/缺失分布規律。結論： 布依族、水族人群的14 bp插入/缺失分布相似，但是與苗族人群的分布存在一定的差異。

[關鍵詞]基因，HLA-G; 14 bp插入/缺失多態; 布依族; 水族; 苗族；貴州

人類白細胞抗原-G(HLA-G)是非經典的HLA I類分子，位于6號染色體HLA-A端粒側。HLA-G基因的多態性水平較其它經典的HLA I類分子低，目前研究最多的是14 bp插入/缺失等位基因多態性。14 bp插入/缺失多態性與各種原因引起的復發性流產、重度子癇前期、潰瘍性結腸炎、系統性紅斑狼瘡及一些慢性炎癥性疾病等的發病及進展有關[1-6]。HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態性不僅與種族有關，還與民族起源相關[7-8]。遺傳背景會影響基因頻率在群體中的分布，而遺傳背景不同所造成的群體分層現象會導致一些研究(尤其是病例-對照研究)中假陽性結果的出現[9-11]。本文選擇同為漢藏語系的布依族、水族和苗族為研究對象，檢測該群體健康個體的14 bp插入/缺失多態性分布頻率，并結合文獻，與仡佬族、壯族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基諾族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南漢族、浙江漢族共13個民族群體進行對比，分析14 bp插入/缺失多態性和群體遺傳背景的相互關系。

1對象與方法

1.1　研究對象

根據知情同意原則，采集貴州省3個少數民族(布依族、苗族、水族)群體共344例健康無親緣關系個體外周血2~5 mL，用于HLA-G基因14 bp插入/缺失多態性分析。采樣時，追溯采血對象3代以上均為本民族，以保證其代表性。

1.2　HLA-G基因14 bp插入/缺失多態性檢測

采用QIAGEN外周血DNA提取試劑盒提取DNA，DU640型核酸蛋白分析儀測定DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性，樣品DNA稀釋至100 mg/L，-20 ℃保存備用。用Primer Premier 5.0 軟件設計PCR引物，上游系列為5′-CCCTCACTGTGACTGATATG-3′，下游系列為5′-CAAAGAGGAGTCAGGGTTC-3′。 25 μL PCR擴增體系組成為10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每種2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，10 μmol/ L上下游引物各1 μL，模板DNA 100 ng。PCR擴增條件為：94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30次循環。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色后在凝膠成像儀上檢測并記錄結果。

1.3　數據統計

計數該群體的基因型頻率和相應的等位基因頻率，用Pypop0.7.0軟件對各群體進行Hardy-Weinberg平衡檢驗(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，群體間等位基因頻率比較用SPSS 17. 0軟件進行χ2檢驗。

2結果

2.1　14 bp插入基因型判定

擴增產物為134 bp的單一條帶，基因型為14 bp插入型純合子(+14 bp/ +14 bp)；擴增產物為106 bp單一條帶的為14 bp缺失型純合子(-14 bp/-14 bp)；兩種條帶均有為雜合子(+14 bp/-14 bp)，如圖1。擴增的產物經純化后測序，并將結果在NCBI Blast中進行比對，結果顯示插入的14 bp片段的基因序列為ATTTGTTCATGCCT，且該序列與HLA-G基因的Exon8的序列一致，說明本研究的分型方法可靠，見圖2。

注：M為DNA MarkⅠ，1、3、4、5、9、13為雜合子(+14 bp/-14 bp)，2、6、7、8、11為缺失型純合子(-14 bp/-14 bp)，10、12為插入型純合子(+14 bp/+14 bp) 圖1　HLA-G基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　The agarose gel electrophoresis figure of HLA-G gene PCR products

2.2　民族群體中HLA-G 14 bp插入/缺失的等位基因、基因型頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗

注：左圖為含14 bp插入的基因序列圖，插入的14 bp序列為ATTTGTTCATGCCT；右圖為14 bp缺失的基因序列圖，如圖箭頭所指出為14 bp缺失的位置圖2　HLA-G基因Exon8 PCR擴增產物測序圖Fig.2　Sequence figures about the PCR products of the HLA-G gene Exon8 region

3個民族(布依族、苗族、水族)群體的14 bp插入(+14 bp)等位基因頻率分別為0.237、0.381、0.260；+14 bp/-14 bp基因型頻率分別為0.381、0.443、0.313；-14 bp/-14 bp基因型頻率分別為0.525、0.398、0.583；+14 bp/+14 bp基因型頻率分別為0.094、0.159、0.104； Hardy-Weinberg 平衡檢驗結果顯示3個群體基因型頻率均符合Hardy- Weinberg 平衡，說明樣品具有代表性。見表1。

表1　不同民族群體HLA-G 基因14 bp插入/缺失基因型、等位基因頻率及Hardy-Weinberg檢驗

2.3　HLA-G基因14 bp插入頻率

3個民族群體HLA-G基因14 bp插入頻率的比較采用χ2檢驗，結果經Bonferroni校正后，取P<0.017為差異具有顯著的統計學意義。結果顯示布依族和苗族差異有統計學意義(χ2=11.345，P=0.001)；苗族與水族差異有統計學意義(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族間比較差異無統計學意義(P>0.017) 。見表2。

2.4　16個不同語族的民族群體的HLA-G 14 bp插入/缺失頻率

結合已有報道的仡佬族、壯族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基諾族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南漢族、浙江漢族共13個民族群體的HLA-G14 bp插入/缺失多態性分布數據[12-15]，將16個民族群體按語系語族的不同分為6組，見表3。再對這6個組進行14 bp插入頻率的χ2檢驗，結果經Bonferroni校正后，取P<0.003 3為差異具有統計學意義。結果顯示漢藏語系壯侗語族與其余5個語族之間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.003 3)，漢藏語系藏緬語族與漢藏語系漢語支比較差異有統計學意義(P=0.001)，其余各組間比較差異無統計學意義(P>0.003 3)，見表4。

表2　3個民族群體的14 bp插入頻率

注：P<0.017為有顯著性差異，括號中數字代表所選擇的該民族群體中所含的個體數

表4　6個不同語族群體HLA-G基因14 bp插入等位基因頻率

注：P<0.003 3為差異有統計學意義

3討論

我國是一個多民族國家，歷史悠久，各民族都形成了自己的民族文化和生活習俗。少數民族人口雖少，但分布很廣。由于地理環境和歷史發展的原因，多數少數民族仍然居住在較封閉的環境中，成為一個遺傳學上相對隔離的群體，所以少數民族群體的遺傳背景相對單純，這對進行人類遺傳多樣性分析以及遺傳疾病基因定位研究具有一定的優勢[12-15]。

本研究選取貴州省黔東南地區的布依族、水族、苗族3個同為漢藏語系的民族進行HLA-G基因14 bp插入/缺失的χ2配對比較，結果顯示苗族14 bp插入頻率分別與布依族、水族比較差異有統計學意義，而布依族和水族之間則無統計學意義。原因可能是布依族和水族同為漢藏語系壯侗語族，都是由古代的“百越”族群發展而來，多居于貴州黔南一帶，兩個群體遺傳背景相似；而苗族屬于漢藏語系苗瑤語族，在發展過程中由于多方面的原因導致其與布依族、水族之間遺傳背景存在一定的差異[12]。因此，可以認為HLA-G基因14 bp插入頻率可能因語族不同而有所差異，這與Tao Y等的研究結果相吻合。

本研究對來自6個不同語族群體的16個少數民族群體的HLA-G基因14 bp插入/缺失多態性進行研究，結果表明：(1)在漢藏語系當中緬藏語族14 bp插入頻率(0.405～0.534)最高，其次是漢語族(浙江漢族和云南漢族，0.403～0.408[13-14])和苗瑤語族(苗族，0.381)，最低是壯侗語族(壯族、傣族、布依族、水族、毛南族、仡佬族，0.260～0.344[8,12-13])；各語族之間比較14 bp插入頻率，苗瑤語族(0.381)與漢語族(0.403～0.408)接近，均低于緬藏語族(0.405～0.534)，同時該3個語族14 bp插入頻率均高于壯侗語族(0.260～0.344)差異有統計學意義。(2)作為阿爾泰語系蒙古語族的土族、裕固族14 bp插入頻率(0.376～0.446)[15]與南亞語系孟高棉語族的布朗族、佤族(0.470～0.609)接近；且均高于漢藏語系各語族，但只與壯侗語族(0.260～0.344)差異有統計學意義。根據如上的結果可以看出HLA-G基因14 bp插入頻率具有語系及語族的分布特點[15]。漢族群體14 bp插入頻率與苗族群體、阿爾泰語系蒙古語族群體、南亞語系孟高棉語族群體均接近，原因可能是隨著時代的發展，人們思想觀念逐漸開放、經濟條件日益好轉、交通設施逐漸完善，使得各民族之間的交流逐漸增多，形成了一個“大雜居，小聚居”的局面，進一步地促進各民族之間的交流與融合。有研究者指出嶺南和西南地區的越人，有的較早與漢族融合，已經逐漸演變形成今天的一些兄弟民族，這些兄弟民族就是屬于漢藏語系壯侗語族的各民族[16]。經過數百年的演變，百越與外族的交流融合已經是一個非常復雜的過程，既有外族成分融入百越，又不斷有百越的成分流向外族，這使得百越族演變而成的這些民族群在不斷的演變與進化過程中形成了自己獨特的遺傳背景，這可能是壯侗語族14 bp插入頻率較本研究中提到的其余語族群體較低的一個原因。

本研究結果顯示3個少數民族群體(布依族、水族、苗族)的基因型和等位基因分布與其他群體的分布有相同的趨勢，在同一研究群體中基因型(+14 bp/+14 bp)頻率和+14 bp等位基因頻率都較低。與其它群體數據比較發現，苗族群體14 bp插入/缺失的分布與其他群體相似，而布依族和水族則有自己獨特的等位基因和基因型分布規律，推測可能與其獨特的遺傳背景相關。

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(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

·專題研究·

Analysis of the 14 bp Insertion/Deletion Polymorphism in Human

Leukocyte Antigen-GGene in Chinese Buyi, Shui,

and Miao Ethnic Groups in Guizhou Province

HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZUO Ya, ZHANG Ting, DENG Jie, WU Changxue, YU Wenfeng, GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the distribution of HLA-G gene 14 bp insertion /deletion polymorphism in Buyi, Shui and Gelao populations and their relationship with genetic background．Methods:PCR amplification, agarose gel electrophoresis and sequencing were used to explore the distribution of 14 bp insertion/deletion in HLA-G gene in 344 healthy people of these three ethnic groups, and the data were compared with that of 13 ethnic groups such as Gelao, Zuang reported in the literature. Results: The frequencies of +14 bp in Buyi, Shui and Miao were 23.7%, 26.0% and 38.1% respectively. The genotype frequencies of +14 bp/+14 bp in Buyi,Shui and Miao were 9.40%, 10.4% and 15.9% respectively. The differences of 14 bp insertion frequencies between Buyi and Miao, between Miao and Shui were statistically significant (P<0.05), while no significant difference was found between Buyi and Shui (P>0.05). When compared with other groups, the distribution characteristic of +14 bp insertion/deletion in Miao was similar to them, but Buyi and Shui showed significance difference from others. Conclusion: The distribution characteristics of +14 bp insertion/deletion in Buyi is similar to Shui, but they are different from that of Miao.

[Key words]gene,HLA-G; +14 bp insertion/deletion polymorphism; Buyi people; Shui people; Miao people； Guizhou

[中圖分類號]R394；R34-33； RZ273

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0217-05

通信作者**E-mail:zhizhongguan@yahoo.com

[基金項目]*國家“十二·五”科技支撐計劃項目(No：2013BAI05B03)； 貴州省科技廳社會發展攻關項目：SY(2012)3135]