腦脊液流式細胞術檢測非霍奇金淋巴瘤中樞神經系統受累的價值*

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腦脊液流式細胞術檢測非霍奇金淋巴瘤中樞神經系統受累的價值*

網絡出版時間：2015-03-19網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1017.025.html

陳夢翔， 黃韻紅**， 胡云飛， 申苗苗， 黃德佩

(貴州省腫瘤醫院 腫瘤科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 評價腦脊液流式細胞術(CSF-FCM)在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中樞神經系統(CNS)受侵的診斷和預后的價值。方法： 18例NHL初治患者，腦脊液(CSF)采用CSF-FCM和腦脊液細胞學(CSF-C)方法檢測，比較兩種方法檢測中樞神經系統(CNS)受累的陽性率，同時觀察患者性別、年齡、臨床分期、B癥狀、乳酸脫氫酶(LDH)、國際預后指數(IPI)評分、體能狀態PS評分等相關臨床因素的關系。結果： CSF-FCM檢測NHL患者CNS受侵的診斷陽性率高于CSF-C，差異有統計學意義(P=0.045)；單因素分析結果顯示CSF-FCM在檢測NHLCNS受累時免疫表型陽性與年齡、B癥狀及LDH有關(P=0.039、0.001及0.009)。結論： NHL累及CNS時CSF-FCM免疫表型檢測優于傳統細胞學檢查。

[關鍵詞]非霍奇金淋巴瘤； 中樞神經系統； 腦脊液； 流式細胞學； 細胞學

侵犯中樞神經系統(central nervous system，CNS)的非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin,s lymphoma，NHL)是一種嚴重危及患者生命的腫瘤，治療效果不佳，預后差，病死率高。在臨床上檢測NHL是否侵犯CNS，對NHL的治療和預后顯得尤為重要。目前診斷NHL患者CNS受累的方法主要包括腦脊液細胞學檢查(cerebrospinal fluid cytology，CSF-C)和腦脊液流式細胞術(cerebrospinal fluid flow cytometry，CSF-FCM)，其中FCM已被較為廣泛的應用到淋巴造血系統疾病的診斷和研究中[1-3]。本研究旨在比較CSF-FCM與傳統CSF-C兩種檢查方法在檢測NHL患者CNS受累情況中的優越性及關系，為臨床檢測NHL中樞神經系統受累情況提供依據。

1材料與方法

1.1　對象

收集淋巴瘤科2012年3月~2013年3月NHL患者18例，男性13例，女性5例，年齡7~74歲，中位年齡49歲。入組病例均經淋巴結或結外組織病理確診為NHL，既往無鞘內注射化療史，參照2012年NCCN指南，同時至少具備以下條件之一：(1)病理類型為淋巴母細胞淋巴瘤(lymphoblalstic lymphoma，LBL)、Burkitt淋巴瘤(burkitt lymphoma，BL)等高度侵襲性淋巴瘤；(2)病變累及鼻竇、睪丸、乳腺、硬膜外、大細胞淋巴瘤侵犯骨髓或本身為艾滋病(human immunodeficiency Virus，HIV)合并NHL；(3)有≥2個結外部位受累和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase ，LDH)升高，結外器官受累≥2個是重要危險因素；(4)兒童NHL，主要包括LBL、BL、間變大細胞淋巴瘤以及彌漫大B細胞淋巴瘤；(5)排除其他原因所致的神經學缺陷以及精神狀態改變。

1.2　方法

記錄患者的性別、年齡、臨床分期、功能狀態(performance status，PS)評分、B癥狀、LDH水平、國際預后指數(international prognostic index，IPI)評分等臨床資料，應用CSF-C和CSF-FCM檢測患者CSF標本的細胞免疫表型，比較兩種方法檢測NHL合并樞受累診斷的陽性率，分析兩種方法與患者年齡、臨床分期、B癥狀及血清LDH等相關臨床因素的關系。

所有入組患者均進行腰穿收集CSF，每位患者的CSF分為2份，每份2~3 mL，分別用于CSF-C及CSF-FCM檢查。(1)CSF-C新鮮CSF標本，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。采用CSF沉淀室法制片，置于4 ℃冰箱中過夜，自然干燥。CSF-C染色采用邁-格-姬(May-Grunwald-Giemsa，MGG) 染色法，光鏡下觀察。(2)CSF-FCM制備單細胞懸液，進行表面標志染色。取3支試管，每管中分別加入20 μL以下抗體或同型對照(管1：CD45、CD20、CD22、CD10、CD5、CD19；管2：CD45、CD2、CD3、CD4、CD38、CD8、CD15、CD13、CD117、CD33、CD14；管3：CD45、CD16、CD64、CD11b、CD34、HLA-DR、CD45、Kappa、Lambda、CD19、CD45、FCM7、CD13、CD23；抗體及同型對照均來自于美國Becton-Dickinson公司)。新鮮CSF標本低速離心，1 000 r/min 5 min，棄上清。在顯微鏡下行CSF細胞計數，調整細胞濃度≤1×106/mL，取80 μL離心后CSF標本，分別加入3支流式管中，流式管中均需加入熒光試劑(PerCP-CY5.5、FITC、PE、APC、PE-CY7、APC-CY7)。混勻后室溫避光孵育15 min，再加入1 mL PBS混勻,低速1 000 r/min 5 min離心，棄上清，洗滌2次。分別再加入200 μL PBS上機檢測，使用Becton-Dickinson公司FACSDiva Version 6.1.2軟件進行分析。(3)陽性標準CSF-C檢測是對CSF細胞的形態學研究，CSF中發現瘤細胞是診斷的唯一可靠依據。CSF-FCM免疫表型陽性需結合WHO(2008)血液淋巴瘤分類4th Edition進行分類，并參照白血病腦脊液FCM結果分析。FCM陽性：CSF不混血，FCM可檢測到異常免疫表型；CSF混血或血性CSF，FCM異常免疫表型比例高于外周血幼稚細胞比例。

1.3　統計學方法

用四格表資料的χ2檢驗比較兩種方法的優越性；CSF-FCM檢測陽性與臨床相關風險因素的關系用Logistic回歸分析；兩種檢查方法一致性用kappa檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。經SPSS 19.0統計軟件包分析。

2結果

2.1　CNS受累情況

CSF-C與CSF-FCM檢測NHL患者CNS受累患者的病例數分別為0例和5例，診斷陽性率分別為0和27.8%。CSF-FCM診斷NHL患者CNS受累的陽性率高于CSF-C，差異有統計學意義(P=0.045)。NHL患者年齡<60歲、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B癥狀及LDH升高時，CSF-FCM優于CSF-CC，P值分別為0.042、0.041、0.021、0.029，見表1。

表1　兩種方法與總病例臨床因素檢測結果(n)

2.2　NHL患者CSF-FCM結果

CSF-FCM檢測陽性率與年齡有關，平均(24±16)歲(t=-2.255，P=0.039)，并與有B癥狀(χ2=10.879，P=0.001)及LDH升高(χ2=6.923，P=0.009)有關，見表2。本組病例經CSF-C細胞學檢查未見陽性樣本，暫不能推斷FCM及細胞學兩種檢查方法在診斷NHL侵犯CNS時一致性的吻合度。CSF-FCM檢測陽性的5例患者，結合臨床表現及輔助檢查，明確NHL侵犯CNS的有2例，1例為48歲女性(左乳腺彌漫大B細胞淋巴瘤)，見圖1-A；1例為7歲男孩(淋巴母細胞淋巴瘤)，見圖1-B；2例患者于診斷CNS受累后2~3月內死亡。

表2　FCM與臨床因素回歸分析

3討論

CNS侵犯是非霍奇金淋巴瘤的嚴重并發癥，易導致患者死亡[7-10]。研究統計淋巴瘤發生CNS受累患者中數生存期為2.4~4.4個月[9-11]。有CNS侵犯的NHL患者，為避免延誤治療或治療過度，臨床上急切需要尋找NHL侵犯CNS的確切診斷依據。

細胞形態學檢查易受主觀因素影響，CSF-C檢查需要一定的細胞數量，若細胞濃度太低，則很難獲得準確的結果[12]。本組18份CSF標本中，經CSF-C檢查未發現陽性樣本，而CSF-FCM檢查發現5例陽性病例，可以認為是CSF-C檢查的局限性，造成漏診。但由于樣本較少，還不能對CSF-FCM及CSF-C兩種檢查方法診斷NHL侵犯CNS進行評價。

圖1　NHL患者CSF-FCM陽性腦脊液檢測Fig.1　CSF-FCM results of two NHL patients

當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用。Hegde U等[13]應用輕鏈與B和T細胞多種抗體系列的多色FCM來檢測其相應抗原的新生物細胞，在CSF總淋巴細胞數僅占0.2%時仍可檢出。FCM極為敏感，能檢出異常的單克隆B細胞，而單克隆B細胞僅占淋巴細胞總數的0.01%。本組18份CSF標本中，腦脊液FCM陽性率為27.8%，而最終結合臨床特征發現確切的CNS受侵的樣本數為2例，而這兩例患者經CSF-C檢查均未見異常，CSF-FCM證實為CNS侵犯的患者分別于診斷CNS受累后2~3月死亡，與文獻報道一致[9-11]。本組CSF-FCM診斷陽性率高于CSF-C檢查，可見CSF-FCM在檢測NHLCNS侵犯時診斷陽性率比細胞學高，更容易發現CSF的病變，能對細胞學假陰性結果所致的遺漏給予補充。

本組病例中有1例確診B細胞來源的淋巴母細胞淋巴瘤患兒，經CSF-FCM檢查證實CNS受侵，原幼細胞占獲取細胞的87.2%，主要表達CD2、CD5、CD3、CD4、CD8、CD38，提示為T細胞來源的淋巴母細胞淋巴瘤。因此，CSF-FCM檢查能提示NHL中樞受侵時B或T細胞來源，為臨床治療提供正確的指導。

結果顯示在檢測NHL侵犯CNS時，CSF-FCM檢查免疫表型優于傳統細胞學，與年齡<60歲、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B癥狀及LDH升高有關。因此在臨床工作中，對高度懷疑CNS侵犯，而CSF-C未發現確切證據的NHL病例，建議行CSF-FCM檢查，可能更容易獲取診斷依據。

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(2014-12-13收稿，2015-01-25修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

The Values of CSF Flow Cytometry in Detecting CNS Involvement

in the Non-Hodgkin's Lymphomas

CHEN Mengxiang, HUANG Yunhong, HU Yunfei, SHEN Miaomiao, HUANG Depei

(DepartmentofOncology,GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the value of diagnosis and prognosis with cerebrospinal fluid flow cytometry (CSF - FCM) in non-hodgkin's lymphoma (NHL) of the central nervous system (CNS) invaded. Methods: CSF-FCM and CSF cytology were employed to detect cerebrospinal fluid (CSF) of 18 NHL patients of initial treatment, positive rate of central nervous system (CNS) involvement detected by the two methods were compared, at the same time, the correlation among clinical factors such as patients' gender, age, clinical stage, B symptoms, lactate dehydrogenase (LDH), international prognostic index (IPI) score, PS score of physical state was observed. Results: The diagnostic positive rate of CSF-FCM in detecting NHL patients with CNS invaded was higher than that of CSF-C, the difference was statistically significant (P=0.045). Single factor analysis showed that immune phenotypes of NHL which CNS invaded detected by CSF-FCM was correlated to age, B symptoms and LDH (P=0.039, 0.001 and 0.009).Conclusions: CSF-FCM immune phenotypic detection is superior to the conventional cytology when CNS involvement in NHL.

[Key words]non-Hodgkin's lymphoma; central nervous system; cerebrospinal fluid; flow cytometry; cytology

[中圖分類號]R733.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0283-05

通信作者**E-mail:pdhuangyh@sina.com

[基金項目]*貴州省科技廳社發攻關項目[黔科合LG字(2012)063號]