酪酸桿菌對水浸小鼠應激性胃潰瘍的防治效果觀察

徐敏，黃玨瑋，付瑤陽，張浩，方思維，郭雷，王方巖(溫州醫科大學基礎醫學院，浙江溫州505;溫州醫科大學第一臨床醫學院; 溫州醫科大學第二臨床醫學院)

酪酸桿菌對水浸小鼠應激性胃潰瘍的防治效果觀察

徐敏1，黃玨瑋2，付瑤陽1，張浩1，方思維3，郭雷2，王方巖1
(1溫州醫科大學基礎醫學院，浙江溫州325035;2溫州醫科大學第一臨床醫學院; 3溫州醫科大學第二臨床醫學院)

摘要:目的探討酪酸桿菌對水浸應激性胃潰瘍的預防治療作用及機制。方法將30只ICR小鼠隨機分為正常組、模型組、酪酸桿菌組各10只。酪酸桿菌組予酪酸桿菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，連續5天。末次灌胃后饑餓24 h，模型組與酪酸桿菌組采用束縛水浸應激法制作小鼠胃潰瘍模型。造模結束后頸椎脫臼處死小鼠，測定潰瘍面積并計算潰瘍面積百分率;采用HE染色法觀察各組胃黏膜組織損傷程度;免疫組化法檢測各組增殖細胞核抗原(PCNA)表達;硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法分別檢測胃組織丙二醛(MDA)和超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)。結果與模型組比較，酪酸桿菌組潰瘍面積明顯下降(P＜0.01);胃黏膜組織病理變化較輕;胃黏膜層細胞PCNA表達量顯著增加;胃組織MDA含量下降，SOD、CAT活性明顯提高(P均＜0.01)。結論酪酸桿菌可能通過減輕機體氧化應激反應，促進胃黏膜細胞增殖，減小潰瘍面積，減輕胃部病理變化，對水浸應激性胃潰瘍發揮明顯的防治作用。

關鍵詞:胃潰瘍;抗潰瘍藥;酪酸桿菌;防治作用;氧化應激;水浸

應激性胃潰瘍指當機體遭遇各種強烈的有害刺激時引起的胃黏膜急性潰瘍及糜爛;其并發癥有出血、穿孔、幽門梗阻甚至癌變，若不及時治療，可導致死亡［1］。酪酸桿菌在治療腸道疾病方面已有幾十年的臨床應用歷史，療效頗佳，但其在胃潰瘍方面的研究少有涉及［2］。酪酸桿菌主要代謝產物為丁酸和氫氣，丁酸是腸黏膜再生和修復的重要營養物質，而氫氣具有廣譜的抗炎作用，同時對應激性胃潰瘍也具有治療作用［3～5］。2012年4月～2013年5月，我們觀察了酪酸桿菌對小鼠水浸應激性胃潰瘍的預防治療效果，現分析結果，探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料本實驗室保藏酪酸桿菌株(CGMCC NO.8808); SPF級雄性ICR小鼠30只，體質量(25 ±2)g，購自溫州醫科大學實驗動物中心; BCA蛋白定量試劑盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒(碧云天生物技術研究所);超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所); TPY液體培養基(青島海博生物技術有限公司);增殖細胞核抗原(PCNA)抗體(北京博澳森生物技術有限公司)。

1.2酪酸桿菌活化與傳代取適量酪酸桿菌活菌充分溶于5mL TPY培養基中，活化后將培養基置于37℃厭氧培養箱中培養20 h。按4%的接種量接種傳代，至第三代活性最高，可用以灌胃治療。

1.3胃潰瘍模型制作與干預將30只小鼠隨機分為正常組、模型組和酪酸桿菌組各10只。酪酸桿菌組予酪酸桿菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，連續5天。正常組給予TPY培養基0.4mL灌胃，1 次/d，連續5天。末次灌胃后饑餓24 h，模型組和酪酸桿菌組制作應激性胃潰瘍模型:戊巴比妥鈉0.15mL/10 g腹腔麻醉。將小鼠固定牢固，待其清醒后將其浸入(23±0.5)℃的水中8 h，水浸至劍突部。

1.4相關指標觀察

1.4.1潰瘍面積造模結束后，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，4只胃結扎幽門和賁門，向胃內注入20%甲醛溶液后取下，并放入盛有10%甲醛溶液的燒杯中，靜置10min后取出沿胃大彎剖開，展開胃，用濾紙緩緩吸干水分，觀察胃潰瘍狀況，進行掃描后再利用軟件Image-Pro Plus 6.0測量的數據計算出潰瘍面積百分率。潰瘍面積百分率=(潰瘍面積/胃總面

積)×100%。其他胃組織取下并在冰生理鹽水中輕輕涮洗，儲存于液氮中，用于生化指標檢測。

1.4.2胃黏膜組織病理學變化采用HE染色法。將甲醛固定的胃進行石蠟包埋，切片機切片，HE染色。將切片脫蠟水化后，放入蘇木素染色45 s，再用流水稍洗數秒。隨后用1%鹽酸乙醇分化切片，PBS緩沖液返藍，再將切片用伊紅染色，流水稍洗較長時間后進行乙醇脫水，二甲苯透明，最后滴上中性樹膠進行封片。HE染色后的病理切片制作完成后，鏡檢觀察胃黏膜病理學變化。

1.4.3胃黏膜組織PCNA表達采用免疫組化法。將甲醛固定的胃進行石蠟包埋，切片機切片。將切片用進行常規免疫組化反應。免疫組化后的切片鏡檢觀察胃組織細胞PCNA抗體表達情況。根據參考文獻［6］確定PCNA表達及陽性判斷標準。

1.4.4胃黏膜組織MDA含量及SOD、CAT活性測定采用硫代巴比妥酸法。取胃組織勻漿液，加樣、比色，各種試劑按試劑盒要求配制，按順序依次加入試劑及樣品，充分混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，100℃水浴15min，取出后流水冷卻，1 000 r/min離心10min，取上清液于532 nm處測各管吸光度值。根據標準曲線計算獲得MDA的摩爾濃度(μmol/gprot)。SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法。取胃組織勻漿液，加樣、比色，試劑按試劑盒要求配制，按順序依次加入試劑及樣品，充分混勻，置37℃恒溫水浴40min后加顯色劑，混勻，室溫放置10min，于波長550 nm處，蒸餾水調零，比色，測各管吸光度(OD)值。SOD活力(U/mL)=(對照管OD值－測定管OD值)/對照管OD值/ 50%×(反應液總體積/取樣量)。CAT活性測定原理: CAT分解H2O2的反應可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生淡黃色的絡合物，在405 nm處測定生成量，利用對照管和測定管的吸光度差異即可求出每毫克蛋白CAT活力(U/mg prot)。步驟:取胃組織勻漿液進行測定，加樣、比色;各種試劑按試劑盒要求配制，按順序和分組依次加入試劑及樣品，混勻后于波長405 nm處，蒸餾水調零，測各管OD值。CAT活力(U/mgprot)=(對照管OD值－測定管OD值)×271/(60×取樣量)/待測樣本蛋白濃度。

1.5統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1潰瘍面積及百分率正常胃黏膜標本無出血斑點。模型組胃黏膜可見片狀出血灶，部分黏膜脫落，上附有深黑色血痂。酪酸桿菌組胃黏膜局部皺縮，分布有少量點狀出血灶，上附有淺棕色血痂。見插頁Ⅰ圖3。酪酸桿菌組及模型組潰瘍面積百分率分別為21.75%±6.47%和84.63%±18.75%，兩組比較P＜0.01。

2.2胃黏膜組織病理學變化正常組胃黏膜結構正常，清晰完整。模型組胃壁四層結構層次清楚，上皮不完整，局部腺體結構紊亂，腺腔內較多脫落的上皮細胞碎片，胞質染色淺，可見透明環狀空暈;黏膜表層可見多處帶狀缺損。酪酸桿菌組胃上皮缺損范圍小，腺體排列較整齊，其中酪酸桿菌組上皮深層結構完整、連續。見插頁Ⅰ圖4。

2.3胃黏膜組織PCNA表達光鏡下觀察，正常組胃組織黏膜層細胞可見PCNA表達，呈強陽性。模型組胃組織黏膜層細胞PCNA幾乎無表達，酪酸桿菌組胃組織黏膜層細胞PCNA的表達與模型組比較則顯著增加，呈現強陽性。見插頁Ⅰ圖5。

2.4mDA含量及SOD、CAT活力各組MDA含量及SOD、CAT活性比較見表1。

表1　各組MDA含量及SOD、CAT活性比較()

表1　各組MDA含量及SOD、CAT活性比較()

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別　nmDA(μmol/g)SOD(U/mgprot)CAT(U/mgprot)正常組6　0.64±0.05　88.26±6.85　3.52±0.21模型組　6　2.90±0.48　34.07±5.50　1.44±0.14酪酸桿菌組　6　1.60±0.12*　51.67±2.55*　2.30±0.72*

3　討論

水浸應激性胃潰瘍是由于受到應激性刺激，交感神經興奮，血管收縮，引起黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降;同時副交感神經-垂體-腎上腺系統興奮性增高，引起胃酸、胃蛋白酶和胃泌素分泌增加所致［1，5，6］。在應激狀態下，由于損傷因素的刺激和保護機制的減弱，可出現下丘腦調控垂體等內分泌腺體功能障礙、胃黏膜微循環障礙、壁細胞激活、胃黏膜屏障受損、迷走神經興奮性異常增高、胃黏膜內脂質過氧化物含量升高和氧自由基產生增加等多方面的變化，最終導致潰瘍的發生和發展［6］。本研究中采用的束縛水浸應激法能在較短時間內誘導胃潰瘍，這一模型已被廣泛用以研究應激性胃潰瘍的發生機制以及治療藥物的篩選等方面。

本研究結果表明，與模型組比較，酪酸桿菌組潰瘍面積明顯減小，證實酪酸桿菌可減小潰瘍面積，提高潰瘍抑制率。酪酸桿菌組胃潰瘍黏膜組織病理變化明顯輕于模型組，證實酪酸桿菌對胃黏膜有保護作用。PCNA為反映細胞增殖情況的指標，能夠判斷胃黏膜的損傷與修復情況。本研究通過免疫組化

發現，正常組胃組織黏膜層細胞可見PCNA表達，呈強陽性;模型組胃組織黏膜層細胞幾乎無PCNA表達，酪酸桿菌組胃組織黏膜層細胞PCNA的表達與模型組比較則顯著增加，呈現強陽性。提示酪酸桿菌對小鼠胃組織的修復再生有促進作用。MDA是機體脂質氧化的產物，其含量可間接反映機體受損傷程度。SOD、CAT是機體內的抗氧化酶體系，在正常情況下，由于機體內含有SOD、CAT等自由基清除劑，使自由基得以及時清除，機體僅有少量自由基存在，這種氧化與抗氧化系統保持著動態平衡，使機體免受危害，SOD、CAT活性可反映機體清除自由基的能力［7］。本研究結果顯示，酪酸桿菌組MDA明顯低于模型組，SOD和CAT活性明顯高于模型組，證實酪酸桿菌可減少MDA的生成，減輕氧化應激反應，以上結果進一步證明了酪酸桿菌對水浸應激性胃潰瘍具有良好的防治作用。

綜上所述，酪酸桿菌對水浸應激性胃潰瘍有一定的防治作用;其機制可能與減輕機體內氧化應激反應有關。本研究為應激性胃潰瘍的臨床治療及用藥提供了實驗依據。

參考文獻:

［1］林科名，丁世蘭，王強松，等.左金丸總生物堿對束縛水浸應激性胃潰瘍模型大鼠神經體液調節的影響［J］.中國藥理學通報，2013，5(3): 401-405.

［2］Liu X，Chen Z，Mao N，et al.The protective of hydrogen on stressinduced gastric ulceration［J］.Int Immunopharmacol，2012，13(2): 197-203.

［3］Zhang HQ，Ding TT，Zhao JS，et al.Therapeutic effects of Clostridium butyricum on experimental colitis induced by oxazolone in rats［J］.World J Gastroenterol，2009，15(15): 1821-1828.

［4］Scheppach W，Weiler F.The butyrate story: old wine in new bottles ［J］.Curr Opin Clin Nutrmetab Care，2004，7(5): 563-567.

［5］胡曉年，張娟，向前，等.謂葆對胃炎及胃潰瘍作用的研究［J］.中國現代醫藥雜志，2005，7(6): 25-27.

［6］杜秀芳，楊拯，孟玲，等.應激性胃潰瘍的治療研究進展［J］.現代預防醫學，2008，35(19): 3858-3859.

［7］王聯民，梁玉杰，段永強，等.敦煌大寶膠囊對衰老模型大鼠腦組織氧自由基域影響的研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2009，15(7): 506-507.

收稿日期:( 2014-09-14)

通信作者:王方巖，E-mail: wzyxywfy@126.com

基金項目:溫州市科技局項目(Y20130215);浙江省新苗計劃項目(2014R413032)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0024-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R573.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.008