1型糖尿病小鼠鈣磷代謝研究

姜愛(ài)玲,　刁騰月,　潘　海,　張　巖

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海　200093)

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1型糖尿病小鼠鈣磷代謝研究

姜愛(ài)玲,刁騰月,潘海,張巖

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海200093)

摘要：通過(guò)對(duì)1型糖尿病小鼠模型的研究,檢測(cè)其尿液、血清、骨骼中鈣、磷含量.腹腔注射鏈脲佐菌素(40 mg/kg),連續(xù)5 d,誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型.使用鈣、磷試劑盒檢測(cè)血清、尿液、骨骼中的鈣、磷含量.糖尿病小鼠血磷升高(P< 0.05),尿磷降低(P< 0.05),尿鈣升高(P< 0.05).股骨中鈣、磷(P< 0.05)含量較正常組降低,脛骨中鈣含量降低(P< 0.05).研究表明,高血糖引起尿鈣流失增加,繼而導(dǎo)致骨骼鈣溶出增加,骨鈣含量降低.另外,高血糖引起尿磷排泄減少,從而導(dǎo)致高血磷狀態(tài).

關(guān)鍵詞：糖尿病; 鈣; 磷; 骨

Albright于1948年首先報(bào)道了長(zhǎng)期糖尿病患者可誘發(fā)骨質(zhì)疏松.經(jīng)過(guò)近30年的研究,發(fā)現(xiàn)糖尿病病人骨折的發(fā)生率明顯增高,骨折愈合緩慢[1-2].1976年光子吸收法測(cè)量骨密度技術(shù)的問(wèn)世,為日益突出的糖尿病引發(fā)骨量減少的檢測(cè)提供技術(shù)基礎(chǔ)[3].鈣、磷對(duì)動(dòng)物體新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用,鈣是動(dòng)物骨中含量最多的無(wú)機(jī)礦質(zhì)元素,是構(gòu)成動(dòng)物骨骼的主要成分.絕大部分鈣和磷形成骨中礦物鹽的主體羥基磷灰石及無(wú)定形的膠體磷酸鈣,與膠原結(jié)合共同沉積于骨骼中,維持其正常力學(xué)性能[4].

臨床研究顯示,1型糖尿病能夠誘導(dǎo)骨礦含量降低[5],而對(duì)于1型糖尿病動(dòng)物的分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),小腸、腎臟負(fù)責(zé)鈣主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白分子含量降低[6],因此,可以推斷1型糖尿病誘發(fā)體內(nèi)鈣、磷代謝異常,并對(duì)骨組織產(chǎn)生損傷,影響骨礦正常的生理代謝.基于此,本研究通過(guò)構(gòu)建1型糖尿病小鼠模型,探究其體內(nèi)的鈣、磷代謝,從而能更好地理解1型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的病理進(jìn)程.

1材料與方法

1.1主要試劑、儀器、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑、儀器為:鈣、磷、肌酐試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司,中國(guó));鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ; sigma公司,美國(guó));戊巴比妥鈉(sigma公司,美國(guó));血糖儀(OneTouch UltraEasy,美國(guó));酶標(biāo)儀(Bio-Tek,美國(guó));馬弗爐(Vulcan3-550,美國(guó));離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));超低溫冰箱(New Brunswick,英國(guó)).

DBA/2J小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供.動(dòng)物合格證號(hào):2007000524918;許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005.動(dòng)物自由攝食、飲水,于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(溫度26±2 ℃,相對(duì)濕度50%~60%,光照/黑暗交替12 h)適應(yīng)1周后,開(kāi)始實(shí)驗(yàn).倫理批準(zhǔn)文號(hào):10PJ1407700.

1.2動(dòng)物模型建立及分組

采用10周齡雄性DBA/2J小鼠建立糖尿病模型.取10只小鼠作為正常對(duì)照組;另10只小鼠腹腔注射STZ(40 mg/kg),持續(xù)注射5 d,每次注射前禁食4 h.注射完成1周后,尾部取血,使用血糖儀測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG高于9 mmol/L被認(rèn)為是糖尿病小鼠.實(shí)驗(yàn)期間以及處死動(dòng)物前,監(jiān)測(cè)小鼠FBG.

1.3樣本收集

STZ注射8周后,使用小鼠代謝籠收集尿液,并于-80 ℃保存.使用0.9%的生理鹽水配制戊巴比妥鈉溶液,以50 mg/kg體重的劑量進(jìn)行腹腔注射.小鼠麻醉后,經(jīng)摘眼眶取血,放于1.5 mL離心管,室溫靜置1 h,于4 ℃、5 600 rpm轉(zhuǎn)速下離心6 min,取上層血清,于-80 ℃保存;取小鼠脛骨和股骨,剔除肌肉和結(jié)締組織,放在1.5 mL的離心管內(nèi),-20 ℃保存,用于骨骼鈣、磷含量測(cè)定.

1.4尿液、血清鈣磷含量測(cè)定

將尿液和血清從-80 ℃超低溫冰箱取出,室溫放置、復(fù)溫,待全部融化后,經(jīng)混勻、短暫離心后,使用鈣、磷、肌酐試劑盒測(cè)定尿液與血清中相應(yīng)指標(biāo)的濃度,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.5骨骼鈣磷含量測(cè)定

1.5.1樣品溶液的制備

60 ℃烘烤樣品72 h到恒重,之后在馬弗爐中800 ℃煅燒6 h,待充分冷卻后,稱灰重.每份樣品取出一半骨灰量,用6 mol/L的鹽酸溶液溶解,稀釋20倍配成待測(cè)溶液.

1.5.2鈣磷濃度測(cè)定

同尿液、血清鈣磷含量測(cè)定方法.

1.6數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示.使用t檢驗(yàn)組間差異,P< 0.05表明兩組間有顯著差異.

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1小鼠空腹血糖水平

在STZ注射后1周、5周、8周3個(gè)時(shí)間點(diǎn),正常對(duì)照組小鼠空腹血糖值都處于正常水平,而STZ注射組小鼠空腹血糖值都高于9 mmol/L,并且隨時(shí)間延續(xù),血糖值逐步升高,被認(rèn)為是高血糖模型成功,結(jié)果如表1所示.

表1　空腹血糖水平(Mean±SEM,n=10)

2.2尿液中鈣、磷水平

與正常對(duì)照組相比,糖尿病小鼠尿磷排泄降低(P< 0.05),而尿鈣水平顯著升高(P< 0.05),結(jié)果如表2所示.

表2　尿液中鈣磷水平(Mean±SEM,n=10)

*P< 0.05, vs.正常對(duì)照組

2.3血清中鈣、磷水平

與對(duì)照組相比,糖尿病小鼠血磷水平明顯升高(P< 0.05),結(jié)果如表3所示.

表3　血清中鈣磷水平(Mean±SEM,n=10)

*P< 0.05, vs.正常對(duì)照組

2.4骨骼灰分鈣磷水平

對(duì)骨骼灰分的檢測(cè)結(jié)果顯示,糖尿病組脛骨(P< 0.05)和股骨(P< 0.05)Ca含量均顯著低于對(duì)照組,股骨(P< 0.0.5)磷含量顯著低于對(duì)照組,結(jié)果如表4所示.

表4　骨骼灰分鈣磷水平(Mean±SEM,n=10)

*P< 0.05, vs.正常對(duì)照組

3討論

本實(shí)驗(yàn)顯示,1型糖尿病小鼠尿磷降低,血磷升高,這與患1型糖尿病的青少年的臨床研究結(jié)果相一致[7].這可能是由于長(zhǎng)病程糖尿病易導(dǎo)致腎臟疾病,引起腎損傷,腎排磷減少,導(dǎo)致血磷升高.對(duì)基因敲除小鼠研究也證實(shí)了高磷血癥加劇糖尿病腎病[8].這提示在對(duì)糖尿病患者治療中應(yīng)兼顧腎臟疾病的監(jiān)測(cè).

糖尿病組中高尿鈣的出現(xiàn),則是由于患者體內(nèi)的血糖處于高水平,出現(xiàn)高滲透利尿狀況,導(dǎo)致尿鈣含量升高.高尿鈣可以導(dǎo)致維生素D代謝異常,進(jìn)而導(dǎo)致1型糖尿病小鼠腎臟鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)降低[9].臨床研究顯示,1型糖尿病患者血清胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的含量和活性都降低,同時(shí),骨礦含量降低[10].鈣負(fù)平衡導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn),甲狀旁腺激素分泌增多,刺激破骨細(xì)胞分化,骨吸收增強(qiáng)[11-12].同時(shí),血磷增加會(huì)促進(jìn)血鈣向骨組織轉(zhuǎn)移并沉積,而高血磷還會(huì)抑制腎近曲小管細(xì)胞線粒體中的1-α羥化酶的活性,使腎內(nèi)活性維生素D合成和分泌減少,降低了腸道鈣吸收功能.在以上兩方面作用下,血清中鈣離子水平下降,從而阻礙骨形成和骨組織礦化[13].

通過(guò)對(duì)小鼠骨鈣磷含量的檢測(cè),可看出1型糖尿病小鼠由于高血糖滲透利尿?qū)е骡}、磷代謝異常,最終導(dǎo)致骨骼中鈣磷含量降低.鈣、磷是骨基質(zhì)的主要組成成分,在合理控制糖尿病患者血糖的同時(shí),應(yīng)及時(shí)檢測(cè)其鈣、磷水平,加強(qiáng)對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防.

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Calcium-Phosphorus Metabolism of Type 1 Diabetic MiceJIANG Ailing,DIAO Tengyue,PAN Hai,ZHANG Yan

(School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for

Science and Technology,Shanghai 200093,China)

Abstract：The contents of calcium and phosphorus in urine,serum,and bone of mice with type 1 diabetes were investigated.The streptozotocin was injected into the mice intraperitoneally at 40 mg/kg of body weight for 5 consecutive days to induce diabetic models.The contents of calcium and phosphorus were detected by calcium and phosphorus detection kits respectively.In the mice with diabetes mellitus,serum phosphorus ascends (P<0.05),urinary phosphorus descends (P<0.05),and urinary calcium ascends (P<0.05).Calcium (P<0.05) and phosphorus (P<0.05) in femur and calcium (P<0.05) in tibia both descend.Thus,the hyperglycemia leads to the increasing loss of calcium in urine and bone,consequently induces the decrease of bone calcium content.In addition,the hyperglycemia leads to the decreased level of urinary phosphorus,and then induces the hyperphosphatemia status.

Key words：diabetes mellitus; calcium; phosphorus; bone

中圖分類號(hào)：R 335

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A