磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態位點基因突變及蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關聯性研究

翟艷春，魏文強，何 燕，李新慶，王 嵬，劉 芬

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磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態位點基因突變及蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關聯性研究

翟艷春，魏文強，何 燕，李新慶，王 嵬，劉 芬

目的 探討磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)基因中的單核苷酸多態性(SNP)rs11677 C/T多態位點基因突變及蛋白表達與食管鱗狀細胞癌(ESCC)臨床病理特征的關系。方法 選取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高發區，首次經組織病理學確診的食管ESCC患者260例，血液標本采用MassArray時間飛行質譜生物芯片檢測PLA2G2A基因rs11677 C/T位點基因型；采用免疫組織化學染色方法(SP法)檢測癌及癌旁組織中PLA2G2A蛋白的表達情況。比較不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T陽性率及PLA2G2A蛋白表達陽性率，不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率。結果 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多態位點CC型 66.2%(172/260)、CT+TT型 33.8%(88/260)。攜帶CC基因型者PLA2G2A蛋白表達陽性率(56.4%，97/172)與攜帶CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。不同年齡、組織學分化、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。不同年齡、組織學分化、TNM分期、淋巴結轉移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同浸潤深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。不同rs11677C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.149，P=0.928)。結論 未發現PLA2G2A基因 rs11677 C/T多態位點基因突變與其蛋白表達的相關性，PLA2G2A蛋白表達與食管ESCC浸潤深度相關。

食管腫瘤；癌,鱗狀細胞；Ⅱ型磷脂酶A2；多態性,單核苷酸

翟艷春，魏文強，何燕，等.磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態位點基因突變及蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關聯性研究[J].中國全科醫學，2015，18(12)：1396-1400.[www.chinagp.net]

Zhai YC,Wei WQ,He Y,et al.Correlation among PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism,protein expression and clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma[J].Chinese General Practice，2015，18(12)：1396-1400.

食管癌是一種常見的人類消化道惡性腫瘤，其5年生存率為10%～15%[1]。食管癌的病理類型包括鱗狀細胞癌(ESCC)和腺癌2種類型，我國食管癌90%是ESCC[2]。磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)被報道在人類多種腫瘤中有表達，包括結腸癌、胰腺癌及前列腺癌[3]，并且在炎性反應、血管生成及腫瘤發生發展過程中發揮重要作用[4]。本研究采用MassArray時間飛行質譜生物芯片檢測PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型在ESCC患者中的分布情況，結合免疫組織化學方法檢測PLA2G2A蛋白表達情況，探討PLA2G2A基因rs11677 C/T多態位點基因突變及蛋白表達的臨床意義，為食管ESCC的診治提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高發區，首次經組織病理學確診的食管ESCC患者260例，收集手術切除癌及癌旁組織(患者術前均未接受化療、放療或其他任何相關的腫瘤治療)標本以及靜脈血2 ml。其中，血標本進行PLA2G2A基因rs11677 C/T多態性檢測，癌組織及癌旁組織進行免疫組織化學染色檢測。260例食管ESCC患者中，男182例，女78例；年齡33～79歲，中位年齡60歲；分化程度：高分化45例、中分化124例、低分化91例；腫瘤分期：Ⅰ期37例、Ⅱ期127例、Ⅲ期89例、Ⅳ期7例；淋巴結轉移118例、無淋巴結轉移142例。

1.2 試劑 PLA2G2A兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司，超敏SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司設計，Enzyme、Buffer、dNTP購自Mannheim公司，樹脂購自Sequenom公司。

同行評議：

本研究探討了磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)基因rs11677 C/T多態位點基因突變及其蛋白表達與食管鱗狀細胞癌(ESCC)的關聯性，為闡明ESCC的遺傳易患性提供了新的理論依據。本研究設計嚴謹，資料齊全，有一定創新性，有指導和參考價值。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色SP法 按照北京中杉金橋生物技術有限公司SP免疫組織化學試劑盒操作說明書進行。常規切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫10 min阻斷內源性過氧化物酶的活性，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復10 min，冷卻至室溫。牛血清清蛋白封閉50 min，加入PLA2G2A兔抗人多克隆抗體(一抗)(ab23705,1∶200；Abcam,Cambridge,MA,USA)，濕盒孵育4 ℃過夜。次日室溫復溫，加入二抗孵育60 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，鹽酸-乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，陽性對照切片由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，PLA2G2A蛋白反應為棕黃色顆粒定位于細胞質。

1.3.2 MassArray時間飛行質譜生物芯片測定單核苷酸多態性(SNP) 利用MassArray Assay Design(Sequenom) 軟件設計引物，上游引物為5′-ACGTTGGATGACCTCAACTCCGTGCTTAAC-3′，下游引物為5′-ACGTTGGATGGGCAATGCATACACACACAC-3′。引物合成后，所有DNA樣本稀釋到10～50 ng/μl，取1 μl將其與1.8 μl水、0.5 μl PCR、0.4 μl 氯化鎂(MgCl2)、0.1 μl dNTP、1 μl PCR 引物混合在一起。PCR反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；共45個循環；最終72 ℃ 5 min，降溫至25 ℃。對上步的PCR產物進行SAP酶消化，該反應在37 ℃進行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活；降溫至25 ℃。該步完成之后，將消化后的產物進行單堿基延伸反應，條件如下：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；52 ℃ 5 s；80 ℃ 5 s；5個內部循環；72 ℃ 3 min。共40個外部循環；降溫至25 ℃。結束上述反應后，將產物進行樹脂純化，將所有產物中的鹽離子清除。將最終的分型產物點樣到芯片上，進行MALDI-TOF質譜檢測。最后結果由MassArray RT軟件系統實時讀取，并通過軟件系統完成基因分型分析。

1.4 結果判定 免疫組織化學結果由2名病理學專家獨立進行判讀，結果采用半定量方法。判定標準如下：+陽性細胞數<5%;++陽性細胞數5%～30%；+++陽性細胞數>30%。統計分析時陽性細胞數≥5%判定為陽性，<5%判定為陰性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件包進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型與蛋白表達的相關性 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多態位點CC型66.2%(172/260)、CT+TT型33.8%(88/260)。攜帶CC基因型者PLA2G2A蛋白表達陽性率(56.4%，97/172)與攜帶CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比較，差異無統計學意義(χ2=0.12，P=0.913)。癌組織免疫組織化學檢測發現，PLA2G2A蛋白表達陽性呈棕黃色顆粒狀，主要分布于細胞質中，而正常組織中無陽性表達(見圖1)。

注：A為食管ESCC癌組織，B為正常組織

圖1 食管ESCC癌組織與正常組織PLA2G2A免疫組織化學染色 (×400)

Figure 1 PLA2G2A immunohistochemical staining in ESCC tissues and normal tissues

2.2 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較 不同年齡、組織學分化、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of the positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T among ESCC patients groups with different clinical features

臨床特征例數基因型CC TT+CTχ2值P值年齡(歲)0.1200.729 ≤503019(63.3)11(36.7) >50230153(66.5)77(33.5)組織學分化0.2560.880 高4529(64.4)16(35.6) 中12481(65.3)43(34.7) 低9162(68.1)29(31.9)TNM分期1.0960.778 Ⅰ3725(67.6)12(32.4) Ⅱ12781(63.8)46(36.2) Ⅲ8962(69.7)27(30.3) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴結轉移0.2600.610 無14292(64.8)50(35.2) 有11880(67.8)38(32.2)浸潤深度2.3640.500 T14430(68.2)14(31.8) T23722(59.5)15(40.5) T3176117(66.5)59(33.5) T433(100.0)0

注：PLA2G2A=磷脂酶A2-ⅡA亞型

2.3 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較 不同年齡、組織學分化、TNM分期、淋巴結轉移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同浸潤深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.4 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.149，P=0.928，見表3)。

3 討論

在中國，食管ESCC是食管癌主要病理類型，大約占所有食管癌的90%[5]，是侵襲性極強并且預后很差的腫瘤之一。在中國北部，尤其是靠近太行山一帶，食管ESCC在癌癥致死疾病中占首位[6]。食管癌的發病因素很多，目前公認吸煙、飲酒、對食管造成損傷的各類慢性刺激及環境因素是中國食管ESCC高發的主要原因。調查發現，喜吃燙食、超量飲酒、低收入、低體質指數、既往食管病變、不按時就餐、喜食辣食及腫瘤家族史等均是增加食管癌患病風險的因素[7-8]。近年來，與食管ESCC發生、演化相關的基因水平的研究越來越受到人們的重視。已有研究表明，PLA2G2A在食管ESCC癌組織和食管正常組織中的表達存在差異[9]。

表2 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different clinical features

臨床特征例數PLA2G2A蛋白陽性 陰性χ2值P值年齡(歲)1.2400.266 ≤503016(53.3)14(46.7) >5023098(42.6)132(57.4)組織學分化0.8830.643 高4517(37.8)28(62.2) 中12455(44.4)69(55.6) 低9142(46.2)49(53.8)TNM分期6.7170.081 Ⅰ3723(62.2)14(37.8) Ⅱ12752(40.9)75(59.1) Ⅲ8935(39.3)54(60.7) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴結轉移1.4150.234 無14267(47.2)75(52.8) 有11847(39.8)71(60.2)浸潤深度10.3600.016 T14428(63.6)16(36.4) T23711(29.7)26(70.3) T317674(42.0)102(58.0) T431(33.3)2(66.7)

表3 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達陽性率比較〔n(%)〕

Table 3 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different rs11677 C/T genotypes

rs11677C/T基因型例數PLA2G2A蛋白陽性 陰性CC17297(56.4)75(43.6)CT7340(54.8)33(45.2)TT159(60.0)6(40.0)

磷脂酶A2(PLA2) 是一類能催化水解磷脂Sn-2 位脂肪酸磷酸甘油酯酰基酯鍵形成游離脂肪酸及溶血磷脂的酶族。PLA2主要有4種類型:分泌型、胞質型、非鈣離子依賴型及脂蛋白相關型；其中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)包括約10種亞型，ⅡA亞型(sPLA2-ⅡA)主要來源于非胰腺組織，如白細胞、血小板和胎盤等[10]。人類的sPLA2-ⅡA首先從類風濕患者的滑膜液中發現并分離獲得[11]。在其免疫防御功能得到肯定的同時，作為花生四烯酸代謝通路上游的第一個限速酶，sPLA2-ⅡA與消化系統腫瘤癌前病變、細胞增殖、血管侵襲和腫瘤轉移等關系的研究取得了一定的進展[12-13]。1997年，Cormier研究小組首次發現PLA2G2A具有對抗小鼠腸管腫瘤發生和增殖的功能[13]。然而研究結果顯示，PLA2G2A基因并不像傳統的抑癌基因那樣發揮作用，在人類前列腺癌中PLA2G2A發揮促癌基因的作用[14]，在晚期胃癌患者中PLA2G2A的表達與其存活存在正相關[15]，這就表明在不同類型的消化系統腫瘤中或者在不同的理化條件下，PLA2G2A對腫瘤所發揮的作用存在著一定的差異，有時甚至相反[16]。

本課題前期的研究表明，PLA2G2A基因rs11677 C/T多態位點基因突變與食管ESCC風險有關，與攜帶與CC基因型者比較，攜帶CT+TT基因型者食管ESCC發病風險降低[17]。本研究結果顯示，攜帶不同基因型者PLA2G2A蛋白表達陽性率無差異。另外，PLA2G2A蛋白表達與食管ESCC臨床特征關系中，除不同浸潤深度間存在差異外，其他臨床特征間均無差異。不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型間均無差異。

綜上所述，本研究未發現PLA2G2A基因rs11677 C/T多態位點基因突變與其蛋白表達的相關性，但PLA2G2A蛋白表達與食管癌浸潤深度相關。研究結果仍需更多大樣本、多中心研究進一步驗證。

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(本文編輯：陳素芳)

Correlation Among PLA2G2A rs11677 C/T Polymorphism,Protein Expression and Clinicopathologic Features of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

ZHAIYan-chun,WEIWen-qiang,HEYan,etal.

DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealth,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

Objective To investigate the correlation among the phospholipase A2 group ⅡA(PLA2G2A) gene single nucleotide polymorphism(SNP)(rs11677 C/T),the protein expression and the clinicopathologic characteristics of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods A total of 260 ESCC patients from Linzhou city,Henan province,an area of high incidence of esophageal cancer,were selected as study subjects from October 2009 to September 2010,ESCC was confirmed by histopathologic examination for the first time.Blood specimens were used to detect the PLA2G2A rs11677 C/T SNP genotype by time-of-flight mass spectrometry MassArray system,and the carcinoma and pericarcinous tissues were used to examine the expression of PLA2G2A protein by immunohistochemical SP method.The positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T and PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different clinical features,the positive rates of PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different rs11677 C/T genotypes.Results Among 260 ESCC patients,the distribution of CC,TT+CT genotype of PLA2G2A rs11677 C/T SNP was 66.2%(172/260) and 33.8%(88/260),respectively.There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression between cases with CC genotype(56.4%,97/172) and cases with CT+TT genotype(55.7%,49/88)(P>0.05).The genotypes rate of PLA2G2A rs11677 C/T did not vary by age,histological differentiation,TNM stage,lymphatic metastasis and depth of invasion of ESCC(P>0.05).The positive rate of PLA2G2A protein expression did not vary by age,histological differentiation,TNM stage and lymphatic metastasis(P>0.05).There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression among ESCC patient groups with different rs11677 C/T genotypes(χ2=0.149，P=0.928).Conclusion The correlation between PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism and the PLA2G2A protein expression is not significant,while PLA2G2A protein expression is closely related to the depth of invasion of ESCC.

Esophageal neoplasms；Carcinoma,squamous cell；Group Ⅱ phospholipases A2；Polymorphism,single nucleotide

國家自然科學基金資助項目(81473056,30901239)；北京市自然科學基金面上項目(7132023)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目(CIT&TCD201404183)

100069北京市，首都醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，北京市臨床流行病學重點實驗室(翟艷春，何燕，王嵬，劉芬)；中國醫學科學院腫瘤醫院流行病室(魏文強，李新慶)

王嵬，100069北京市，首都醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，北京市臨床流行病學重點實驗室；

E-mail:wei6014@yahoo.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.12.010

2014-12-16；

2015-02-12)

劉芬，100069北京市，首都醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，北京市臨床流行病學重點實驗室；

E-mail：liufen05@ccmu.edu.cn