磷脂酰肌醇3激酶和細胞外調節蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細胞增殖的協同調控作用

徐 慧，戴元榮，付玉茹，夏夢玲

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·論著·

磷脂酰肌醇3激酶和細胞外調節蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細胞增殖的協同調控作用

徐 慧，戴元榮，付玉茹，夏夢玲

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路對支氣管哮喘(簡稱哮喘)大鼠氣管平滑肌細胞(ASMC)增殖的協同調控作用。方法 6～8周齡SPF級雄性SD 大鼠，復制大鼠慢性哮喘模型，離體培養大鼠氣管ASMC，將細胞分為正常組、哮喘組、轉化生長因子β1(TGF-β1)組、TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+渥曼青霉素(wortmannin)組、TGF-β1+PD98059+wortmannin組。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖情況及Western blotting法檢測磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)表達情況。結果 CCK-8法檢測各組大鼠ASMC OD 值，TGF-β1組高于正常組和哮喘組，TGF-β1+ PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組低于TGF-β1組，TGF-β1+ PD98059+wortmannin組低于TGF-β1+ PD98059組和TGF-β1+wortmannin組(P<0.01)。Western blotting法檢測ASMC中p-Akt的表達，哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+wortmannin組低于TGF-β1組(P<0.01)。Western blotting法檢測ASMC中p-ERK1/2的表達，哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+ PD98059組低于TGF-β1組(P<0.01)。結論 PI3K和ERK信號通路協同調控了TGF-β1刺激哮喘大鼠ASMC增殖過程。

哮喘；信號通路；肌細胞,平滑肌；細胞增殖；磷脂酰肌醇3-激酶類；細胞外調節蛋白激酶

徐慧，戴元榮，付玉茹，等.磷脂酰肌醇3激酶和細胞外調節蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細胞增殖的協同調控作用[J].中國全科醫學，2015，18(9)：1032-1036.[www.chinagp.net]

Xu H,Dai YR,Fu YR,et al.Coordinated regulation of the proliferation of airway smooth muscle cells by ERK and PI3K signal pathways in asthmatic rats [J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1032-1036.

氣管重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)發病的重要環節，其中氣管平滑肌細胞(airway smooth muscle cell,ASMC)的增生和肥大在氣管重塑中發揮了重要作用[1]。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)能刺激ASMC的分裂與增殖[2]。近年的研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)及細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)介導的信號通路在ASMC增殖中發揮著十分重要的作用[3-4]。細胞信號通路并不都是線性化的，即不都是單純由某一條信號通路級聯傳遞完成的。據此，本研究以PI3K和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC的調控為切入點，探討PI3K和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC增殖的協同調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質量100～120 g，購自上海實驗動物中心〔合格證號：SYXK(浙)2010-0150〕。飼養于溫州醫科大學實驗動物中心SPF級實驗室，飼養溫度25 ℃，相對濕度70%，晝夜照明12 h/12 h。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔多克隆抗磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體購自美國CST公司，磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)抗體(美國abcam公司)，TGF-β1購自美國PeproTech公司，25 cm2無菌培養瓶購自美國Corning公司，RPMI 1640培養基購自美國HyClone公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司，優級胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青鏈霉素和胰酶細胞消化液購自江蘇碧云天生物工程有限公司，5%CO2培養箱購自美國Thermo公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司，ECL試劑盒購自Gene 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠的二抗購自江蘇碧云天生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠模型的建立 將大鼠按照隨機數字表法分為哮喘組(15只)和對照組(15只)。適應性飼養于溫州醫科大學實驗動物中心1周后，哮喘組分別于第1天和第8天大鼠腹腔注射含1 mg卵清蛋白(OVA)和100 mg氫氧化鋁〔Al(OH)3〕的混合溶液1 ml致敏，第15天開始激發，將大鼠置于自制的霧化箱內，使用超聲霧化器噴入含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液8 ml，30 min/次，隔天1次，共8周；對照組致敏和激發階段均使用0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠末次激發24 h后處死，模型制備成功后行組織切片觀察氣管形態。

本研究創新點：

氣管重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)重要的特征，找到逆轉氣管重塑的靶點將為治療哮喘開辟新的方向。然而氣管重塑的機制尚未明確，氣管平滑肌作為氣管壁的主要結構，是哮喘氣管重塑及氣流受限的主要效應細胞。轉化生長因子β1(TGF-β1)是導致氣管重塑的重要因子，許多實驗已證實其可促進細胞外基質沉積、氣管平滑肌細胞增生、黏液分泌。既往研究也有探討哮喘發病機制中相關信號傳導通路，但較少同時研究兩條信號通路和探討兩者之間是否存在相互作用。本實驗以支氣管平滑肌細胞為研究靶點，探討TGF-β1導致氣管平滑肌細胞重塑可能的機制為重點，發現其導致氣管平滑肌細胞增殖與兩條重要的信號通路有關，且這兩條信號通路不是孤立的，而是存在交叉作用，共同調節了TGF-β1刺激引起的氣管平滑肌細胞的增殖，從而導致了支氣管哮喘的氣管重塑。

1.2.2 肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠末次激發24 h后，經腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動脈放血處死，迅速游離完整的心肺組織，結扎左主支氣管及右中葉支氣管，4%多聚甲醛溶液注入右肺下葉，結扎并游離右肺下葉，將其浸入4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋，做病理切片。將制備好的肺組織切片進行HE染色。

1.2.3 ASMC的培養和鑒定 利用組織塊貼壁法進行ASMC培養，待細胞長滿后用胰酶細胞消化液傳代，取3～6代細胞進行實驗。采用細胞免疫組化和透射電鏡對培養的ASMC進行鑒定。

1.2.4 CCK-8(cell counting kit-8)法檢測ASMC的增殖 取3～6代細胞，用含10%FBS的RPMI 1640培養基培養，將細胞調至濃度為4×103/ml的混懸液，接種于96孔板，待細胞融合后，換無血清RPMI 1640繼續培養，使細胞同步于G0期，換用含10%FBS的RPMI 1640培養基培養。采用隨機數字表法將細胞分為6組：正常組、哮喘組、TGF-β1組、TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+渥曼青霉素(wortmannin)組、TGF-β1+PD98059+wortmannin組。TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組分別于TGF-β1干預前加入PD98059、wortmannin及PD98059+wortmannin預處理1 h。培養結束時，再于每孔中加入10 μl的CCK-8，混勻后置于5%CO2孵箱，37 ℃，培養2 h，采用酶聯免疫檢測儀于450 nm波長測定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt、p-ERK1/2的表達 培養結束后，提取各組細胞總蛋白質，以BCA法進行蛋白定量。按每孔30 μg蛋白量加樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白轉膜至PVDF膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加p-Akt(1∶800)、p-ERK1/2(1∶2 000)及GAPDH抗體(1∶5 000)孵育，4 ℃過夜。TBST緩沖液洗膜后加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶1 000)及山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影。用AlphaEaseFC 4.0軟件分析目的蛋白p-Akt、p-ERK1/2和內參GAPDH的OD值，以目的蛋白和內參GAPDH OD值的比值代表目的蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理學改變 大鼠肺組織HE染色觀察顯示，氣管壁及血管周圍有大量炎性細胞浸潤，平滑肌層增厚，黏膜皺褶增多，支氣管上皮水腫、脫落、結構紊亂，黏液腺及杯狀細胞增加；對照組未見明顯炎性細胞浸潤、平滑肌層增厚等情況(見圖1)。

2.2 ASMC的鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，ASMC呈梭形，有較長的突起，細胞核位于細胞中央，細胞疏密相間，呈典型的“谷和峰”生長狀態。α-actin細胞免疫化學染色可見免疫反應產物呈棕黃色，95%細胞α-actin染色陽性，透射電鏡下觀察可見細胞內的縱行肌絲結構(見圖2)。

2.3 CCK-8法檢測各組細胞增殖情況 不同組大鼠ASMC OD 值比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中TGF-β1組高于正常組和哮喘組，TGF-β1+ PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組低于TGF-β1組，TGF-β1+ PD98059+wortmannin組低于TGF-β1+ PD98059組和TGF-β1+wortmannin組，差異均有統計學意義(P<0.01，見表1)。

2.4 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt和p-ERK1/2的表達 不同組大鼠ASMC中p-Akt比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+wortmannin組低于TGF-β1組，差異均有統計學意義(P<0.01，見表2、圖3)。

不同組大鼠ASMC中p-ERK1/2比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+ PD98059組低于TGF-β1組，差異均有統計學意義(P<0.01，見表3、圖4)。

表1 各組大鼠ASMC OD 值比較

注：TGF-β1=轉化生長因子β1，wortmannin=渥曼青霉素，OD值=吸光度值；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01；與TGF-β1+PD98059組比較，☆P<0.01；與TGF-β1+wortmannin組比較，★P<0.01

表2 各組大鼠ASMC中p-Akt比較

注：p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01

Table 3 Comparison of p-ERK1/2 in ASMC in different groups of rats

組別p-ERK1/2正常組0.43±0.09哮喘組1.34±0.13*TGF-β1組2.18±0.15△TGF-β1+PD98059組0.28±0.06▲F值175.48P值<0.01

注：p-ERK1/2=磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01

注：A為對照組，B為哮喘組

圖1 大鼠肺組織病理學改變(HE染色，×400)

Figure 1 Pathological changes of lung tissues of rats

注：A透射電鏡下觀察(× 6 000),B倒置顯微鏡下觀察(×100),C特異性免疫化學染色(×200)；ASMC=氣管平滑肌細胞

圖2 ASMC的鑒定

Figure 2 Identification of ASMC

注：A為TGF-β1組，B為哮喘組，C為正常組，D為TGF-β1+wortmannin組

圖3 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt的表達

Figure 3 Expression of p-Akt in ASMC by Western blotting

注：A為TGF-β1組，B為哮喘組，C為正常組，D為TGF-β1+ PD98059組

圖4 Western blotting法檢測ASMC中p-ERK1/2的表達

Figure 4 Expression of p-ERK1/2 in ASMC by Western blotting

3 討論

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣管炎癥性疾病，該疾病具有反復性、長期性和周期性的顯著特點。氣管重塑是其重要病理特征之一，ASMC在哮喘氣管重塑的發生發展過程中發揮著重要作用[5]。TGF-β是結構相關的生長因子大家族的一員，也是人體內的主要形式，與肺部疾病的慢性進展關系最為密切。Cohell等[6]發現，哮喘患者發作期支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1水平較控制期明顯增高；在中重度哮喘患者氣管黏膜活檢標本中，TGF-β1mRNA和TGF-β1過度表達[7]，故其與氣管重塑有著重要的關系[8]，并且通過與受體的特異性結合來發揮作用。Ward等[9]研究指出，TGF-β1的表達水平與氣管狹窄有關，是引起哮喘氣管重塑的關鍵遞質。本研究也發現，哮喘大鼠ASMC的增殖較正常大鼠明顯；同時通過TGF-β1對哮喘大鼠ASMC進行刺激發現，TGF-β1組ASMC的增殖較哮喘組明顯，證實了TGF-β1可以增加ASMC的增殖，進而引起氣管重塑。

有研究表明，TGF-β1可能是通過ERK信號途徑促進大鼠ASMC的增殖作用[10]。本研究發現，在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中，TGF-β1組p-ERK1/2表達高于哮喘組，提示ERK信號途徑在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中發揮了重要作用。在加入抑制劑PD98059干預后，TGFβ1+ PD98059組ASMC增殖較TGF-β1組減少，但較哮喘組表達量仍有所增加，提示TGF-β1促進大鼠ASMC的增殖與ERK信號通路有關，PD98059能抑制上述效應，但不能使其恢復至哮喘組水平，說明TGF-β1引起的細胞增殖過程中，ERK信號通路可能不是TGF-β1引起的ASMC增殖的唯一通路。

PI3K是介導生長因子、細胞因子和炎性遞質誘導ASMC增殖的另一條重要通路，Akt在P信號通路中起著關鍵作用[11]。Akt的底物較多，包括BAD、環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)、叉頭轉錄因子家族、IK-B激酶等，其底物的多樣性說明了Akt在細胞增殖、細胞分化和細胞存活中的廣泛作用。本研究發現，在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中，TGF-β1組p-Akt表達明顯高于哮喘組，提示PI3K信號通路在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中發揮了重要作用。

本研究結果顯示，TGF-β1刺激哮喘ASMC增殖的過程中，分別加用這兩條通路的抑制劑PD98059、wortmannin，實驗發現p-ERK1/2和 p-Akt的表達量明顯減少，ASMC增殖減少。提示這兩條通路在TGF-β1刺激哮喘ASMC增殖過程中均發揮重要作用。本研究進一步運用ERK通路抑制劑和PI3K/Akt通路抑制劑進行聯合干預發現，與單獨使用ERK通路抑制劑、PI3K/Akt抑制劑比較，ASMC增殖抑制更為明顯，以上結果提示，PI3K信號通路和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC增殖可能具有協同效應，其機制可能是共同調控了ASMC增殖過程。

綜上所述，TGF-β1刺激在引起的哮喘大鼠ASMC增殖過程中，PI3K和ERK信號通路均參加了對其的調控，兩者之間存在交叉對話，起到了協同調控的作用。

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(本文編輯：陳素芳)

Coordinated Regulation of the Proliferation of Airway Smooth Muscle Cells by ERK and PI3K Signal Pathways in Asthmatic Rats

XUHui,DAIYuan-rong,FUYu-ru,etal.

DepartmentofRespiratory,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China

Objective To investigate the coordinated regulation of the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMC) by phosphoinositide-3-kinase(PI3K)and extracellular regulated protein kinases(ERK) signal pathways in asthmatic rats.Methods SPF Sprague Dawley rats of 6 to 9 weeks old were used to establish chronic asthma model.ASMC was cultured in vitro and the cells were divided into normal group,asthma group,TGF-β1group,TGF-β1+ PD98059 group,TGF-β1+wortmannin group and TGF-β1+PD98059+wortmannin group.CCK-8 method was used to detect cell proliferation and Western blotting method was used to detect the expression of p-Akt and p-ERK1/2.Results The OD value of ASMC was determined by CCK-8 method,with the TGF-β1group and TGF-β1+PD98059+wortmannin group significantly higher than the normal and asthma group,the TGF-β1+ PD98059 group and TGF-β1+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1group,and the TGF-β1+ PD98059+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1+ PD98059 group and TGF-β1+wortmannin group(P<0.01).The expression level of p-Akt in ASMC was determined by Western blotting method,with the asthma group significantly higher than the normal group,the TGF-β1group significantly higher than the asthma group,and the TGF-β1+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1group(P<0.01).The expression level of p-ERK1/2 was also determined by Western blotting method,with the asthma group significantly higher than the normal group,the TGF-β1group significantly higher than the asthma group,and the TGF-β1+ PD98059 group significantly lower than the TGF-β1group(P<0.01).Conclusion The signal pathways of PI3K and ERK may coordinately regulate the proliferation of ASMC stimulated by TGF-β1.

Asthma；Signaling pathway；Myocytes,smooth muscle；Cell proliferation；Phosphatidylinositol 3-kinase；Extracellular regulated protein kinases

浙江省自然科學基金資助項目(Y2080466)；溫州市科技局項目(Y20130351)

325027 浙江省溫州市，溫州醫科大學附屬第二醫院呼吸科

戴元榮，325027 浙江省溫州市，溫州醫科大學附屬第二醫院呼吸科；E-mail：daiyr@126.com

R 256.12

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.012

2014-10-27；

2015-01-16)