自噬與慢性肝炎病毒感染

劉 青綜述，傅 念審校

（南華大學附屬南華醫院消化內科，湖南衡陽421002）

自噬與慢性肝炎病毒感染

劉 青綜述，傅 念審校

（南華大學附屬南華醫院消化內科，湖南衡陽421002）

自噬； 肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒； 感染； 綜述

自噬即“自我消化”，是將細胞內大分子物質及亞細胞器通過溶酶體途徑進行降解以便循環利用，實現物質及細胞器更新的分解代謝過程。慢性肝炎病毒感染是導致肝硬化及肝癌最主要的病因，且目前暫無有效藥物能完全清除病毒。近年研究表明，自噬在慢性肝炎病毒感染中扮演著重要角色，本文就自噬與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒感染的發生機制進行綜述，以期為抗病毒治療提供新途徑。

1 細胞自噬

1.1 自噬的概述及分類 自噬是指在細胞受外界環境干擾等情況下利用溶酶體途徑，對胞漿內無功能大分子物質和受損的細胞器進行降解、回收、利用，來維持細胞器的更新及細胞本身的代謝需要的生物學過程。在營養充足、外界環境良好等狀態下，細胞自噬處于較低水平，然而在氧化應激、饑餓、生長因子缺乏、內質網應激、病毒感染等條件下可短時間內誘導自噬發生，通過清除毒物為細胞提供營養物質及能量[1-2]。

根據生理功能及降解物進入溶酶體方式的不同，一般可將自噬大致分為以下3類：分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediatedautophagy）、微自噬（microautophagy）、大自噬（macroautophagy），其中，大自噬主要分為6個步驟完成：啟動、成核、伸長、關閉、成熟、降解或釋放。此外，還有非典型性自噬和最新報道的RNA自噬[3]。目前研究最深入的為大自噬。本綜述主要論述的是大自噬。

1.2 細胞自噬的分子生物學機制 自噬發生的各個階段受多種基因的調控，參與自噬編碼的基因稱自噬相關基因（autophagy-related genes，ATG）。ATG基因編碼的蛋白如第三類磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）以協同的方式參與自噬體形成的各個階段。PI3KC3是啟動自噬的關鍵酶，其能催化3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）的形成，對誘導自噬的發生起著重要作用[4]。PI3KC3由3個核心部分組成：hVPS34、p150和Beclin-1[4-5]；Beclin-1可與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）形成復合體（VPS34），參與初級自噬囊泡的形成[6]。自噬的伸展是由Atg12和Atg8/微管相關蛋白1輕鏈3（micro tubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）2個泛素蛋白共軛系統共同調節，Atg12與靶蛋白Atg5、Atg6共價結合形成Atg12-Atg5-Atg16復合物，募集LC3-Ⅱ結合到隔離膜，并定位到自噬泡中，從而促進自噬泡膜的延長。當自噬體雙膜結構形成后，Atg12-Atg5-Atg16復合物脫落，自噬體發育成熟[7]。LC3是酵母菌Atg8在哺乳動物中的同源蛋白，分為Ⅰ型和Ⅱ型，當自噬發生時LC3-Ⅰ轉化為定位于前自噬體及自噬體的LC3-Ⅱ型，常用于自噬分子的檢測指標。目前已證實，能調節自噬的信號通路主要包括mTOR，Akt/PKB，ERK/MAPK，Ⅰ型和Ⅲ型PI3K等途徑。mTOR是目前研究最多的信號通路，其mTORC1（由mTOR，PRAS40，MLST8，Raptor和DEP-TOR組成的復合蛋白體）是其表達形式之一，在營養充足時mTORC1使Atg1人的同源蛋白ULK1和ULK2磷酸化，從而抑制自噬，在營養缺乏時mTOR失活，ULK1和ULK2蛋白解離，去磷酸化被激活，啟動自噬發生。

2 慢性肝炎病毒

2.1 乙型肝炎病毒 HBV感染呈全球盛行，目前有近30%的人群通過血清學證據發現感染HBV，慢性乙型肝炎病毒感染患者達3.5億[8]，其有一部分死于病毒感染所致的肝硬化及肝細胞癌。HBV是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，屬嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae），HBV的基因組是部分雙鏈環狀DNA分子，基因組大小為3.2 kb。其長鏈有4個開放閱讀框（open readingframe，ORF），即Pre-S/S、Pre-C/C、Pol和X，乙型肝炎表面抗原、包膜蛋白（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、HBV多聚酶（Pol）和X多肽（HBx）[9]。其中HBx可在低營養狀態下激活細胞自噬水平來提高細胞的存活率[10]。

2.2 丙型肝炎病毒 根據世界衛生組織（WHO）的估計，全世界大概有1.7億人通過血清學檢測發現有丙肝病毒感染，約占總人群的3%，且每年新發丙型肝炎病例達3.5萬例[11]。HCV持續感染若未有效控制可進展為肝硬化和肝細胞癌[12]。HCV歸類于黃病毒科（Flaviviridae），是黃病毒科的唯一嗜肝病毒，其基因組為9.6 kb長的單股正鏈RNA分子，基因組兩側由5′末端和3′末端的非編碼區（untranslated region，UTR）構成，兩UTR之間則是ORF，能編碼結構蛋白和非結構蛋白（NS2，NS3，NS4，NS5）；其中結構蛋白包括核心蛋白（C）和包膜蛋白（E1，E2/NS1）。研究表明，在病毒RNA復制中非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B充當重要角色，此外，HCV的非結構蛋白可以誘導自噬并作為自身抗損傷的保護性機制[13]。

目前，核苷（酸）類藥物或干擾素已成為慢性乙型肝炎的標準化治療方案，但上述抗病毒藥物存在療程長，不良反應多，完全應答率不高甚至無應答等不足。臨床上慢性HCV感染一般采用干擾素和利巴韋林聯合治療，但一旦發展至肝硬化，干擾素和利巴韋林的療效則明顯下降，或不能耐受。目前急需研發新的抗病毒藥物，隨著對自噬與肝炎病毒感染的研究，發現抑制自噬可減少病毒復制，這意味著自噬將有可能為抗病毒治療開辟新路徑。

3 細胞自噬與慢性肝炎病毒感染

3.1 細胞自噬與HBV

3.1.1 HBV誘導自噬發生 體內、體外實驗均發現，HBV感染肝細胞后會增高細胞自噬水平，而自噬水平的增高又反過來促進了HBV的復制[14-15]。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），或者以Atg5和Beclin-1為靶點的shRNA則能抑制自噬體的形成，并抑制HBV的復制，而饑餓誘導或雷帕霉素（西羅莫司）則促進細胞自噬，同時增加HBV的復制[16]。以上研究均表明HBV與自噬相輔相成，相互促進；雖然HBV誘導細胞自噬的具體機制尚不清楚，但近年的研究提示，X多肽（HBx）、HBeAg、HBsAg可能參與了HBV誘導自噬機制的發生。

3.1.2 HBx與自噬 HBx可能通過多種機制參與了細胞自噬的發生：（1）HBx促進自噬體的形成。Liu等[17]發現，Huh7細胞外源表達HBV全基因組蛋白（HBV-DNA）后能顯著增加細胞內的自噬體數量，而Huh7細胞外源表達無HBx的HBV基因組蛋白后自噬體數量并沒有相應增加，提示HBV依賴于HBx促進肝細胞中自噬體的形成。王娟等[18]也證實，HBV通過HBx增加細胞內基本自噬水平，而且還發現C型HBx比B型HBx更能增加細胞內的自噬水平，提示C型HBx能誘發更強的細胞自噬。（2）HBx通過上調Beclin-1的表達促進細胞自噬。HBx蛋白可通過激活死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），上調Beclin-1的表達來增強自噬，并且Beclin-1的表達水平與自噬體數目呈正相關[16，19]；（3）HBx抑制自噬體的降解。HBx除可以提高自噬的表達外，還可以通過抑制溶酶體的成熟及正常酸化從而阻止自噬體的降解[17]。

3.1.3 HBeAg與自噬 研究發現HBV前C區和C區的啟動子G1613A、A1762T/G1764A、G1896A突變能夠降低HBV感染肝細胞的自噬水平，同時G1613A、A1762T/ G1764A突變可使HBeAg水平降低[20-21]，提示HBeAg可能與自噬有相關性，但仍需進一步研究。然而，前C區與X區存在大部分重疊，細胞自噬水平的降低是因為HBeAg水平的變化還是HBx水平的變化所致還有待進一步研究。

3.1.4 HBs與自噬 由于自噬主要作用于HBV病毒包裝，因此有人認為，HBs基因才是引起自噬的主導因素，通過突變分析研究，HBV小表面蛋白（HBV small surface protein，SHBs）可引發自噬，并且可以激活未折疊蛋白應答（unfolded protein responses，UPR），而阻斷UPR信號通路則可消除SHBs所誘導的LC3-Ⅰ的脂化，使細胞自噬水平下降[16]。

3.2 細胞自噬與HCV的關系

3.2.1 HCV誘導自噬發生 HCV感染肝細胞后也能誘導細胞自噬的發生。Ati Goughoulte等[22]用1a基因型HCV感染正常肝細胞后電鏡下可觀察到自噬體積聚，而且熒光顯微鏡下觀察到自噬相關基因Atg5和自噬標記物LC3的水平較對照組明顯增加。Sir等[23]也發現，HCV感染后自噬相關基因如Beclin-1、Atg5、Atg7和Atg12的表達會上調，但聚泛素結合蛋白（p62）及長壽蛋白等的降解未發生明顯的改變。因此，作者猜測HCV誘導的自噬為不完全自噬。另外，HCV可利用自噬增加HCV在細胞內的復制[24]。如果通過抑制Beclin-1、ATG12、ATG4B的表達抑制自噬體的形成，HCV的復制水平則有可能會降低，從而有利于提高抗病毒療效。有趣的是，HCV誘導細胞自噬的發生與HCV病毒基因分型和外周血HCV RNA水平無相關性[25]，作者發現，不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染使用干擾素和利巴韋林治療的療程和療效是不一樣的，降低HCV感染細胞的自噬水平則有可能對不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染均能發揮抗病毒作用。HCV誘導細胞自噬的機制還不是很清楚，可能與UPR和非結構蛋白的作用有關。

3.2.2 HCV通過激活UPR誘導自噬 Huang等[26]發現，HCV通過激活內質網應激反應誘導細胞自噬的發生，以抑制PKB-TSC-Mtorc1信號通路。在細胞中轉染HCV JFH1 RNA可以誘導UPR和不完全自噬，沉默3個UPR信號分子中的任何一個，可使LC3-Ⅱ的生成減少和HCV復制水平下降。HCV感染時，c/EBP同源蛋白（c/EBP homologousprotein，CHOP）在UPR自噬信號中起關鍵作用[27]。但也有人認為HCV誘導細胞自噬與內質網應激無關[28]，Mohl等[29]研究發現，HCV感染誘導的自噬，伴隨著LC3-Ⅱ的聚集，這種變化發生在病毒感染前期，而UPR的刺激只發生在病毒感染的后期，這是否意味著HCV可不通過UPR誘導自噬或是HCV不依賴于UPR誘導自噬，因此還有待進一步研究。

3.2.3 HCV通過非結構蛋白激活自噬 除了病毒觸發的內質網應激和UPR，非結構蛋白可能是HCV激活自噬的另一信號。Su等[13]發現，HCV的非結構蛋白NS4B可以通過Rab5和Vps34的相互作用觸發不完全細胞自噬。此外，HCV非結構蛋白NS5A也能激活細胞自噬反應[30]，NS5A可能通過激活NS5ATP9上調Beclin-1的表達，從而誘導細胞自噬的發生[31]。Gregoire等[32]發現，HCV NS3通過IRGM與Atg5和LC3的相互作用來調節細胞自噬。

3.3 兩種慢性肝炎病毒誘導自噬的相同點與不同點

對比自噬在HBV和HCV中作用的異同可以發現，2種病毒感染不僅可以增強細胞自噬，還可以利用自噬來促進自身在宿主體內復制。然而，HBV誘導的自噬是完整的，而HCV誘導不完整的細胞自噬，HBV可通過HBx、HbeAg、HBs等誘導自噬，而HCV通過UPR、非結構蛋白等誘導自噬，HBV誘導的自噬與基因型有關，而HCV誘導的自噬不依賴HCV的基因型。

4 小結與展望

肝炎病毒感染-病毒攜帶狀態-慢性肝炎-肝硬化-肝癌這一發展路徑已被公認，其關鍵是抗病毒治療。目前HBV感染仍用IFN-α或核苷（酸）類似物治療，HCV感染已有HCV NS3蛋白酶抑制劑（PD）、NS5A與NS5B多聚酶抑制劑等新型藥物，但仍存在耐藥性及不良反應，且病毒完全應答率不高等缺點，因此抗病毒藥物仍有待進一步研究。自噬作為細胞代謝的重要途徑，對細胞內環境的穩定及物質的更新至關重要，當自噬受抑制時，大量異常的蛋白質及受損的細胞器在細胞內聚集，從而干擾細胞代謝及物質更新，誘導疾病的發生。近年來大量的研究表明，HBV和HCV均能誘導細胞自噬，并且利用自噬可增強自身的復制，而相反，抑制細胞自噬則會使HBV及HCV的復制減少，這使細胞自噬作為抗病毒治療成為可能，然而現在對自噬在病毒感染所發揮作用的認識尚淺，病毒感染如何調節自噬通路，如何利用自噬控制復制，需要更深入的研究才能更好地為病毒感染的治療提供幫助。

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A

1009-5519（2015）20-3085-04

2015-05-11）

劉青（1987-），女，湖南長沙人，碩士研究生，主要從事肝硬化防治研究；E-mail：598053742@qq.com。

傅念（E-mail：15874787447@163.com）。