木質纖維分解菌群篩選及其對秸稈分解與畜禽糞便除臭能力評價

楊巧麗，姚 拓，王得武，滾雙寶*

（1．甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州730070；2．甘肅省畜牧獸醫研究所，甘肅平涼744000；3．甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州730070）

木質纖維分解菌群篩選及其對秸稈分解與畜禽糞便除臭能力評價

楊巧麗1，2，姚 拓3，王得武1，滾雙寶1*

（1．甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州730070；2．甘肅省畜牧獸醫研究所，甘肅平涼744000；3．甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州730070）

為獲得高效的木質纖維素分解菌群，并研究該菌群的分解能力及對畜禽糞便利用能力。以牛、雞糞混合儲糞池中土樣為材料，利用限制性培養技術篩選了一組木質纖維素分解菌群；以未經化學處理的秸稈（小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈）為材料，利用失重法測定木質纖維素分解菌群的分解能力及抗雜菌污染能力；以自然風干的畜禽糞便為唯一營養源，初步評定了該菌群對畜禽糞便的利用能力和除臭能力。結果表明，篩選的木質纖維素分解菌群48 h將培養基內濾紙崩解成糊狀，濾紙分解率達84．55%；滅菌條件下接種木質纖維素分解菌群培養6 d，小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈總重量分別減少47．00%，48．62%，50．21%，接入雜菌條件下接種木質纖維素分解菌群培養6 d，小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈總重量分別減少42．14%，44．99%，53．74%；分別以5 g的豬糞、3 g的雞糞為唯一營養源制作100 m L糞便培養液（添加0．35%濾紙），接入木質纖維素分解菌群后，濾紙分別在第3天和第4．5天被分解成糊狀，第8天糞便培養液臭味強度（微弱臭氣味）較對照（強烈臭氣味）明顯減弱。木質纖維素分解菌群能高效降解未經化學處理的玉米秸稈等木質纖維材料，抗外來雜菌能力強，能夠利用畜禽糞便快速分解纖維素，并具有一定的除臭能力，在農業廢棄資源無害化處理及資源化利用等領域具有研究和開發價值。

木質纖維素分解；菌群；農業廢棄資源；秸稈；畜禽糞便；除臭

我國農業有機廢棄資源極其豐富，其中以畜禽糞便和秸稈所占比例最大。據統計，2006年我國畜禽糞便總產量約為32×108t［1］。我國農作物秸稈資源年產量7×108t，占世界總量的25%，其中以玉米稈、稻稈、麥稈為主，約占秸稈資源的75．6%［2-4］。由于農業廢棄資源中含有大量木質纖維素等難分解物質，使得這些廢棄資源在實際生產中難以有效利用，并已成為威脅我國環境安全的主要污染源。另外，畜禽糞便產生的大量惡臭氣體對人畜及周邊的環境造成極為不利的影響［5］，也已成為環境公害之一［6］，研究去除惡臭物質的技術，成為當前科研工作者的一項緊迫任務。

木質纖維素自身分子量大，木質素、半纖維素及纖維素相互纏結，結構復雜，性質穩定［7-9］，自然條件下極難分解。以往木質纖維素分解菌的研究多針對堿等化學方法預處理后的秸稈，如王洪媛和范丙全［10］篩選的一株擴張青霉，對2%NaOH處理后的小麥秸稈10 d分解率為56．3%。王偉東等［11］利用菌種協同理念篩選的菌群對經過NaOH預處理后的秸稈等天然木質纖維原料有極強的分解能力，其中復合系WSC-6接種3 d后對經過堿處理的稻草秸稈分解率達81．3%。李培培等［12］篩選的秸稈還原菌群ADS-3，對用1%NaOH處理的小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）三大農作物秸稈都有穩定高效的分解能力。劉長莉等［13］篩選的常溫纖維素分解菌群能夠在5 d內分解1．5%NaOH處理的水稻秸稈總重量的39．6%。雖然NaOH預處理具有脫木素和降低結晶度的作用［2］，能有效提高木質纖維材料的分解率，但需要中和及回收等工序，實際應用受到一定的限制，目前有關針對未經任何化學方法處理的天然木質纖維素材料分解利用的報道較少［3］。利用微生物除臭劑具有成本低廉、無二次污染等特點，已成為治理惡臭的一個重要研究方向，目前使用的除臭微生物菌劑主要以直接分離篩選單菌株或對分離的單菌株簡單組合的方式獲得。陳麗園等［14］篩選的菌株10MG能使豬糞氨氣和硫化氫氣體的釋放量分別降低67．95%和26．6%。由于臭氣成分復雜，單一微生物除臭效果有限，多種微生物共同作用往往具有更強的除臭效果。葉芬霞等［15］篩選的3株微生物經混合培養，制成復合微生物除臭劑對豬糞、雞糞和牛糞中NH3的去除率達80%以上，H2S的去除率達65%以上。高華等［16］篩選的6株除臭菌經混合培養得到的除臭菌劑對畜禽糞便也具有較強的除臭能力。穩定的微生物系統是保證除臭效果的一個重要因素，但通過直接分離篩選單菌株或對分離的單菌株簡單組合的方式得到的除臭菌劑，在功能及穩定性等方面有一定的局限性。此外，實驗室條件下得到的各種高效微生物菌劑，實際應用中還受環境條件、土著菌及營養條件等因素的限制，不一定都能夠達到預期目標，有些效果微乎其微，甚至是完全失敗的。

本研究以牛、雞糞混合儲糞池中微生物為菌源，以微生物協同作用為出發點，通過傳代與組配的方式篩選了一組木質纖維素分解菌群，以未經化學處理的秸稈為材料，研究了該菌群對木質纖維素的分解能力及抗外來雜菌污染能力，并以自然風干的畜禽糞便為唯一營養源，初步探討了該菌群對畜禽糞便的利用能力及除臭能力，以期為其在秸稈還田、堆肥、沼氣原料預處理及畜禽糞便除臭等領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種來源 土樣采自甘肅農業大學動物養殖場連續使用8 a的牛、雞糞混合儲糞池。

1．1．2 培養基［16-17］蛋白胨5 g，酵母膏5 g，纖維素（新華濾紙）5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7 H2O 0．5 g，FeSO4·7 H2O 0．5 mg，MnSO4·H2O 0．16 mg，ZnSO4·7 H2O 0．16 mg，CoCl20．2 mg，加蒸餾水至1000 m L，p H 7．0，121℃滅菌25 min。

1．1．3 纖維材料 濾紙使用前以1%醋酸浸泡過夜，用蒸餾水沖洗至中性，80℃烘干備用。小麥秸稈、稻草秸稈和玉米秸稈粉碎過1 mm篩，80℃烘至恒重，備用。

1．1．4 雜菌溶液 取800 m L蒸餾水，加入100 g堆肥原料、100 m L生活廢水和5 g NaCl，150 r／min振蕩30 min，靜止30 min后取上清液，即雜菌溶液。

1．1．5 糞便來源 豬糞采自甘肅省蘭州豬場糞池（100日齡長大二元雜交系肥育豬糞便），雞糞采自甘肅農業大學動物養殖場糞池（40日齡AA肉仔雞糞便），自然風干，備用。

1．2 木質纖維素分解菌群的篩選

于2012年9月—2013年1月，從儲糞池不同采樣點（4個）各取土樣5 g，分別接入100 m L培養基內培養（每組設6個重復），命名為第1代，待培養液中濾紙分解至不再明顯變化，取其菌液5 m L接入新鮮培養基（見1．1．2），命名為第2代，重復接種，依次為3，4，……，n代。培養條件：28～34℃，80 r／min微振，微厭氧。根據濾紙條的斷裂程度初步判斷各組初篩菌群的降解效果：＋濾紙邊緣膨脹；＋＋為濾紙邊緣不定形；＋＋＋濾紙整體不定形；＋＋＋＋濾紙成團糊狀；＋＋＋＋＋濾紙完全成糊狀。

對篩選得到的木質纖維素分解菌群培養2 d，測定濾紙的失重量（分解量），計算失重率（分解率），具體方法如下：參考測定飼料粗纖維使用的尼龍袋技術［18］及測定土壤纖維分解強度使用的尼龍網袋法［19］，利用38μm尼龍袋過濾培養基，再用蒸餾水沖洗，80℃烘干至恒重，計算。纖維材料分解率＝（纖維材料原質量＋濾袋質量－烘干后纖維材料與濾袋質量和）／纖維材料原質量×100%。

1．3 木質纖維素分解菌群對秸稈分解能力的測定

1．3．1 滅菌條件下木質纖維素分解菌群對秸稈分解能力的測定 分別稱取小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈1 g為培養基唯一碳源制作100 m L培養基，接入5 m L雜菌溶液，滅菌后接入5 m L木質纖維素分解菌群，培養條件同1．2，分別在第3，6，9和12天測定不同纖維材料的失重量（分解量），計算失重率（分解率），測定方法同1．2。

1．3．2 接入雜菌條件下木質纖維素分解菌群對秸稈分解能力的測定 分別稱取小麥秸稈粉、稻草秸稈粉、玉米秸稈粉1 g為培養基唯一碳源制作100 m L培養基，接入5 m L雜菌溶液和5 m L木質纖維素分解菌群，整個過程不做任何加熱及滅菌處理，培養及測定方法同1．3．1。

1．4 木質纖維素分解菌群對畜禽糞便利用能力及除臭能力的評定

取豬糞2．5，5．0，7．5 g，雞糞1．5，3．0，4．5 g，分別添加0．35 g濾紙（調節反應體系碳氮比；其形狀變化能夠直觀的反映木質纖維素分解菌群對纖維素的分解能力，從而評定該菌群對畜禽糞便的利用能力），加蒸餾水至100 m L（即為糞便培養液），分別接入5 m L木質纖維素分解菌群（糞便培養液中接入5 m L滅活的木質纖維素分解菌群作為對照），進行培養，培養條件同1．2，期間每隔12 h觀察一次濾紙的分解效果。

培養8 d后，打開培養液封口膜，由嗅辨小組（10名研究生組成，均無吸煙或嗅覺障礙，5女5男，年齡在20～27歲之間）對濾紙分解速度最快的組別及相應的對照進行臭味強度評定（評定時掩蓋樣品的標簽，使測定者不知道哪個是實驗組哪個是對照組，以消除心理影響），評定按6個等級進行：無臭味；勉強感覺到臭味；微弱臭氣味；明顯臭氣味；強烈臭氣味；難以忍受的臭氣味。

1．5 數據分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS 18．0統計分析軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2．1 木質纖維素分解菌群的篩選

從儲糞池不同采樣點采集的土樣，初篩得到4組菌群（表1）。培養過程中發現，菌群X1第1代分解速度最快，240 h將濾紙分解成糊狀，此后隨著培養代數的增加，濾紙分解成糊所需時間迅速縮短，第7代48 h左右可將濾紙分解成糊狀（菌群X2和菌群X3呈類似趨勢）。培養至第13代發現菌群X2的濾紙分解能力出現較嚴重的退化，第20代以后，菌群X1和菌群X3的濾紙分解能力也出現了不同程度的退化，推斷可能是由于傳代過程中丟失一些菌種，或菌群分泌的代謝產物積累過多所致。整個篩選過程，菌群X4對濾紙分解能力較差（濾紙變軟、邊緣崩解跡象，但始終不能徹底分解濾紙）。

取4組初篩菌群第15代時的菌液等比例混合接入新鮮培養基，進行培養，得到新的菌群（命為第16代），并繼續傳代培養24代，期間淘汰分解能力差、衰退嚴重及分解能力不穩定的菌群。前后共計40代傳代培養，最終獲得了一組高效、穩定的菌群，由圖1可以看出，該菌群在組配初期（第16代），對濾紙的分解能力極強，36 h可將濾紙分解為糊狀，傳代中后期對濾紙分解能力逐漸穩定，48 h能將濾紙分解呈糊狀，此時測得濾紙分解率達84．55%。

2．2 木質纖維素分解菌群對秸稈的分解能力

2．2．1 滅菌條件下木質纖維素分解菌群對秸稈的分解能力 滅菌條件下，接入木質纖維素分解菌群培養3 d，3種秸稈的分解率達40%左右，此后隨著培養時間的延長，分解速度及相對分解量迅速下降，表明旺盛分解主要集中在前3 d。木質纖維素分解菌群12 d內對3種秸稈的分解率均高于52%，對玉米秸稈的分解率高達58．06%，顯著高于對小麥秸稈和稻草秸稈的分解率（表2）。

2．2．2 接入雜菌條件下木質纖維素分解菌群對秸稈的分解能力 培養基蛋白胨和酵母膏含量較高，營養條件良好，接入雜菌且不做加熱及滅菌處理的條件下，雜菌大量生長。尤其在發酵前期，木質纖維素分解菌群需要快速增殖，是降解反應得以維持的關鍵階段，體系內菌間競爭激烈，木質纖維素分解菌群3 d內對小麥秸稈、稻草秸稈和玉米秸稈的分解率分別為36．02%，41．41%和44．44%，表明木質纖維素分解菌群在大量雜菌存在的條件下具有競爭優勢。隨著培養時間的延長，分解強度逐漸降低，分解速度及相對分解量呈迅速下降趨勢，12 d內對3種秸稈的分解率均高于46%，對玉米秸稈的分解率高達56．79%（表3）。

由表2和表3可知，滅菌條件下與接入雜菌條件下分別接種木質纖維素分解菌群后，3種秸稈的分解量及分解率變化趨勢相近：前3 d分解強度最高，隨培養時間延長，分解強度呈下降趨勢。培養前期（0～3 d），木質纖維素分解菌群在接入雜菌條件下對稻草秸稈和玉米秸稈的分解強度高于滅菌條件下的水平；培養中后期（9～12 d），木質纖維素分解菌群對3種秸稈在滅菌條件下的分解強度高于接入雜菌條件下的水平，表明外來雜菌不一定對木質纖維素分解菌群的分解性能起抑制作用，也表明木質纖維素分解菌群的組成菌種間及菌群與外來雜菌間作用機理極為復雜。

2．3 木質纖維素分解菌群對畜禽糞便的利用能力及除臭能力

木質纖維素分解菌群的營養完全由畜禽糞便提供，濾紙的分解效果能夠較直觀反映木質纖維素分解菌的活性及對畜禽糞便的利用能力。由表4可知，豬糞添加量為5%時，濾紙在第3天分解呈糊狀；雞糞添加量為3%時，濾紙在第4．5天分解呈糊狀，不同糞便添加量下對照組的濾紙在第8天時邊緣膨脹或呈不定形，但始終未被完全分解，表明木質纖維素能夠利用畜禽糞便的營養成分高效分解纖維素。自然風干的糞便中還帶有大量的土著微生物，濾紙能夠快速被分解，表明木質纖維素分解菌群在大量土著菌存在的條件下仍具有競爭優勢。

第8天由10名嗅辨人員對豬糞添加量為5．0%，雞糞添加量為3．0%的糞便培養液及其相應的對照進行臭味強度評定。統計結果見表5，接入木質纖維素分解菌群的培養液臭味強度（微弱臭氣味）較對照（強烈臭氣味）明顯減弱，表明木質纖維素分解菌群對畜禽糞便有一定的除臭作用。

3 討論

3．1 木質纖維素分解菌群的篩選

本研究通過長期傳代與組配相結合的方式，篩選優勢菌種，提高其菌間協同作用。以該方式獲得的木質纖維素分解菌群本身就是一個微生態系統，菌群內微生物個體之間協同作用強，功能穩定、抗外界的干擾能力強，具有純培養的微生物無法比擬的優勢［12］。

3．2 木質纖維素分解菌群對秸稈的分解能力

滅菌條件下和接入雜菌條件下，木質纖維素分解菌群對小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈3 d分解率分別達37．53%，39．51%，42．80%和36．02%，41．41%，44．44%。與王洪媛和范丙全［10］篩選的單菌株以及王慧等［3］篩選的復合系XDC-2，王偉東等［11］篩選的復合系WSC-6，李培培等［12］篩選的復合系ADS-3和劉長莉等［13］篩選的纖維素菌群復合系相比，本研究篩選的菌群具有反應溫度適中、反應底物無需化學處理、前期秸稈分解速度快、抗雜菌污染能力強等優勢。

小麥秸稈、稻草秸稈和玉米秸稈均屬天然高有機分子材料，其化學組成不同，木質纖維素分解菌群對其分解強度有差異，3種秸稈的分解率次序為玉米秸稈＞稻草秸稈＞小麥秸稈，玉米秸稈在培養中后期（3～12 d）的分解量及分解率均高于小麥秸稈及稻草秸稈，推斷木質纖維素分解菌群的該特性可能與菌源采集環境有關：儲糞池中碳源主要以動物（牛）過腹的玉米秸稈為主，長期在該條件下生長的木質纖維素分解菌可能對玉米秸稈有較強的分解能力。

3．3 木質纖維素分解菌群對畜禽糞便的利用能力及除臭能力

長期堆放牛糞、雞糞的混合儲糞池含有大量的木質纖維、粗蛋白及微生物所需的各種元素，木質纖維素分解菌富集，這也是本研究所篩菌群菌株組成多樣性及菌群高效性的基礎。由于木質纖維素菌群菌源來自牛、雞糞混合儲糞池，推斷該菌群對畜禽糞便微環境可能有較好利用及適應能力。經研究發現，木質纖維素分解菌群利用培養液中糞便（豬糞、雞糞）作為營養源，3．0～4．5 d能將培養液中濾紙分解成糊狀，說明該菌群能夠利用糞便中的營養成分高效分解纖維素，同時也說明該菌群對糞便環境具有較好的適應和利用能力，期間糞便中的木質纖維素可能也有一部分被分解，但具體分解量還有待于進一步測定。此外，自然風干的畜禽糞便中有大量的土著微生物（包括畜禽胃腸道微生物［20］及通過空氣和人工操作傳播至糞便中的微生物），該條件下木質纖維素分解菌群能夠利用畜禽糞便高效分解纖維素，進一步證明木質纖維素分解菌群功能的穩定性。

畜禽糞便臭氣是許多單一臭氣物質復雜相互作用的產物，其成分主要包括揮發性脂肪酸（VFA）、酸類（Acids）、醇類（Alcohls）、酚類（Phenols）、醛類（Aldehydes）、酮類（Ketones）、酯類（Esters）、胺類（Amines）、硫醇類（Mercaptans）及含氮雜環化合物等［21-22］。研究表明，豬糞產生的氣體超過168種，而且其中的大部分與臭味相關［5，23-24］，很難根據一種或數種主要成分來準確地描述畜禽糞便臭氣的質和量［6］。嗅覺雖然不能對臭氣組分質化和量化評定，但其具有操作簡單和綜合性強的優點。本研究對臭氣未作稀釋處理，利用嗅覺初步評定了木質纖維素分解菌群除臭能力，結果發現實驗組較對照組臭氣強度降低了近兩個等級（臭味從強烈到微弱），說明木質纖維素分解菌群對豬糞、雞糞臭氣中部分惡臭組分具有極強的去除能力（畜禽糞便產生的惡臭物質具備特異性，稀釋幾百倍后，即使濃度很低但氣味顯著［6］。可見木質纖維素分解菌群在畜禽糞便除臭領域具有研究與開發潛力，但其除臭效果還有待于進一步質化和量化測定。

畜禽糞便產生的臭氣組成復雜，種類多樣，僅依靠一種或幾種微生物很難達到理想的去除效果。在實際生產中，微生物除臭菌劑只有成為優勢菌后才能發揮其作用，因此穩定的微生物系統是保證除臭效果的一個重要因素。本研究以長期堆放牛糞、雞糞的儲糞池中的微生物為菌源，利用傳代培養的方式，得到的木質纖維素分解菌群功能穩定，菌間協同作用強，更有利于除臭作用的發揮，這對現階段除臭微生物篩選方法的改進具有一定的參考價值。

3．4 研究展望

微生物菌劑功能的穩定性、抵抗外來雜菌污染能力、對特定環境的適應性及可利用營養物質的經濟適用性等特征是評價其利用價值的重要指標。本研究篩選的木質纖維素分解菌群能夠高效降解未經化學處理的玉米秸稈等天然木質纖維原料，其功能穩定、抗逆性強，在雜菌數量及種類豐富的條件下具有競爭優勢，并能有效的利用自然風干的畜禽糞便分解纖維素，同時還對畜禽糞便具有一定的除臭能力。因此，在堆肥、秸稈還田、沼氣原料預處理、秸稈類粗飼料加工、規模化養殖場廢水處理及發酵床菌種制備等領域具有較高的研究與開發價值。

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Screening of lignocellulose degrading microbial communities for their ability to deodorize livestock and poultry wastes

YANG Qiaoli1，2，YAO Tuo3，WANG Dewu1，GUN Shuangbao1*
1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Animal Husbandry and Veterinary Institute of Gansu Province，Pingliang 744000，China；3.Pratacultural College，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China

This study aimed to screen microbial communities that can efficiently decompose lignocellulose，as well as determine their ability to deodorize odor of livestock waste．Composted cattle and chicken feces samples were used to cultivate lignocellulose degrading microbial communities based on a restrictive culture technique．These microbes were mixed with unprocessed straws（wheat，rice and corn）．Subsequently，weight loss was used to evaluate the capability of the microbes to decompose lignocellulose and resist microbial contamination．Naturally dried livestock wastes were also used to investigate the ability of these microbes to utilize and deodorize livestock and poultry wastes．Six days after inoculating with lignocellulose microbial communities，weight loss of wheat，rice and corn straw reached 47．00%，48．62%and 50．21%，respectively．In contrast，the weight loss of these straws was 42．14%，44．99%，and 53．74%for wheat，rice and corn respectively in the absence of inoculation．Lignocellulose microbial communities cultivated in excrement nutrient solutions（100 m L）（containing 5 g of swine manure，or 3 g of chicken manure，or 0．35%filter paper）were able to reduce odor intensity after 8 days．In conclusion，lignocellulose microbial communities screened in this study efficiently decomposed cellulose in different straws without chemical pretreatment and were able to resist other bacteria．They were also able to deodorize odor from livestock and poultry wastes．

lignocellulose degradation；microbial community；agricultural waste resources；straw；animal excrement；deodorization

10．11686／cyxb20150124 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

楊巧麗，姚拓，王得武，滾雙寶．木質纖維分解菌群篩選及其對秸稈分解與畜禽糞便除臭能力評價．草業學報，2015，24（1）：196-203．

Yang Q L，Yao T，Wang D W，Gun S B．Screening of lignocellulose degrading microbial communities for their ability to deodorize livestock and poultry wastes．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：196-203．

2013-12-23；改回日期：2014-04-21

“十二五”農村領域國家科技計劃課題（No．2012BAD14B10-5），甘肅省農業科技創新項目（No．GNCX-2012-45）和甘肅省科技創新項目（GMCX-2009-13）資助。

楊巧麗（1987-），女，甘肅華池人，研究實習員。E-mail：yangql0112＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：gunsb＠gsau．edu．cn