有機磷農(nóng)藥高效降解微生物的篩選與鑒定

張六六，夏森玉，丁亞欣，吳 燕，劉 佳

(1. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇無錫 214000；2. 江蘇納克生物工程有限公司，江蘇盱眙 211700;3. 無錫市濱湖區(qū)農(nóng)林局，江蘇無錫 214000)

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有機磷農(nóng)藥高效降解微生物的篩選與鑒定

張六六1,2，夏森玉2，丁亞欣3，吳 燕1，劉 佳1

(1. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇無錫 214000；2. 江蘇納克生物工程有限公司，江蘇盱眙 211700;3. 無錫市濱湖區(qū)農(nóng)林局，江蘇無錫 214000)

摘要[目的]篩選對有機磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種。[方法]在有機磷農(nóng)藥富集地區(qū)采樣，利用選擇培養(yǎng)的方式篩選對有機磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，對篩選到的微生物進行鑒定，并研究其降解特性。[結(jié)果]在長期受有機磷農(nóng)藥污染的環(huán)境下采集56份土壤及污水樣本，從中篩選到可高效降解有機磷農(nóng)藥的菌株JWDP-16，其對氧化樂果的最高降解率達(dá)59.80%，該菌對其他有機磷農(nóng)藥具有廣譜降解能力，同時表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，通過分類鑒定確定該菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。[結(jié)論]菌株JWDP-16對有機磷農(nóng)藥具有高效降解能力，可進一步研究與開發(fā)。

關(guān)鍵詞有機磷農(nóng)藥；微生物降解；分離篩選；菌種鑒定

作為一類高效、廣譜的農(nóng)藥產(chǎn)品，自20世紀(jì)40年代發(fā)明第1個產(chǎn)品“1605對硫磷”以來，有機磷農(nóng)藥(OPs)被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，大幅提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量[1]，目前我國的OPs使用量已占所有農(nóng)藥使用量的70%～80%[2]。隨著OPs在農(nóng)業(yè)上的大規(guī)模使用，其引起的一系列問題逐漸凸顯，所帶來的危害越來越被人們重視：造成病蟲害產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致農(nóng)藥使用量逐漸加大，使得農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力大幅下降，形成惡性循環(huán)；造成嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，直接威脅人類健康；嚴(yán)重污染土壤、水體及大氣環(huán)境，降低了周圍生物種群的多樣性，破壞生態(tài)系統(tǒng)的平衡[3-4]。同時由于OPs的自然降解周期長，使得研究人為加速其降解速度是目前急需解決的關(guān)鍵技術(shù)[5]。由于大部分有機磷農(nóng)藥均為高毒類農(nóng)藥，長期過量使用對人類健康和生活環(huán)境造成嚴(yán)重危害，因此，包括有機磷農(nóng)藥在內(nèi)的化學(xué)農(nóng)藥降解問題已成為目前研究的熱點之一[14]。

由于微生物具有繁殖速度快、代謝能力強、不產(chǎn)生二次污染等特點，因此，利用微生物進行農(nóng)藥的降解是目前解決上述問題的重要手段[6]。農(nóng)藥的微生物降解是指利用微生物的代謝過程使農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其由有害的大分子化合物降解為無害的小分子化合物直至CO2、H2O，實現(xiàn)無害化降解的過程[7]。研究表明，微生物降解農(nóng)藥具有降解速度快、降解效果徹底、環(huán)境影響小、處理成本低等特點[8]。筆者在有機磷農(nóng)藥富集地區(qū)采樣，利用選擇培養(yǎng)的方式篩選了對有機磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，并對篩選到的微生物進行了鑒定，以期為有機磷農(nóng)藥的降解研究及微生物菌劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.2[9]。液體選擇培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后，冷卻至50 ℃左右加入1 g/L有機磷農(nóng)藥。固體選擇培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后，冷卻至50 ℃左右加入1 g/L有機磷農(nóng)藥。

1.1.2 試劑。TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶均為Fermentas產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司。其他試劑均購自國藥試劑公司。

1.1.3藥劑。氧化樂果、甲胺磷、甲拌磷由江蘇揚農(nóng)化工集團有限公司生產(chǎn)；水胺硫磷由湖北仙隆化工股份有限公司生產(chǎn)；二嗪磷由河南地衛(wèi)士生物科技有限公司生產(chǎn)；甲基嘧啶磷由先正達(dá)公司生產(chǎn)；毒死蜱由海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司生產(chǎn)。敵敵畏、敵百蟲、對硫磷由江蘇納克生物工程有限公司惠贈。

1.1.4主要儀器。Biophotometer plus分光光度計(德國Eppendorf公司)、C1000核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、ChemiDoc MP全能型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、AL104型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、PHS-3CT實驗室pH計(上海今邁儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1 樣本的采集。采樣地點：① 江蘇蘇北地區(qū)某有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)污水處理區(qū)及工廠、倉庫周邊土壤；② 無錫附近地區(qū)經(jīng)常噴灑有機磷農(nóng)藥或最近噴灑過有機磷農(nóng)藥的大田、果園、蔬菜大棚等。采樣方法：① 對于土壤樣品的采集，用預(yù)先滅菌的小鏟子取表土及地表下5～10 cm處的土樣1 000 g左右，盛于預(yù)先滅菌的牛皮紙袋中，扎緊[10]；② 對于廢渣等樣品，用預(yù)先滅菌鑷子夾入滅菌的牛皮紙袋中，扎緊；③ 對于污染水樣，用滅菌帶蓋小玻璃瓶盛約100 ml水樣。所有采集得到的樣品均標(biāo)明時間、地點和環(huán)境等情況。

1.2.2 樣本中菌種的分離與純化。稱取1 g(或1 ml)采集獲得的樣本加入到10 ml PBS緩沖液中，振蕩分散2 h。取1 ml振蕩后的溶液加入到100 ml液體選擇培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的菌液涂布于固體選擇培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)并定期觀察，挑取在選擇培養(yǎng)基上正常生長且菌落形態(tài)不同的菌株進行劃線分離直至單菌落，保藏。

1.2.3 高活性、高有機磷農(nóng)藥降解能力菌株的篩選。

1.2.3.1初篩。以菌落在相同條件下菌落生長水解圈的大小和生長繁殖能力作為初篩依據(jù)。首先將分離到菌株點樣接種在固體選擇培養(yǎng)基中央，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其生長情況并測量水解圈的大小，3次重復(fù)。同時用接種環(huán)挑取菌株接種于液體選擇培養(yǎng)基中，每組3次重復(fù)，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定其OD600值。

1.2.3.2復(fù)篩。采用分光光度計測定菌株對氧化樂果的降解能力[11]。磷含量(x)與吸光度(y)之間的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)線性方程(圖1)為：y=0.558 2x+0.016 5,R2=0.999 2。

圖1　磷含量對吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將初篩獲得的菌株接種至液體選擇培養(yǎng)基中，以不接種菌的空液體選擇培養(yǎng)基作為對照，試驗進行5次重復(fù)，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h。采用分光光度法分別測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中有機磷含量，按照公式：有機磷農(nóng)藥降解率=(M2-M1)/M1×100%(其中，M1為培養(yǎng)后的有機磷含量，M2為培養(yǎng)前的有機磷含量)，計算有機磷降解率，考察各菌株對有機磷農(nóng)藥的降解能力。

1.2.4菌種有機磷農(nóng)藥降解特性研究。

1.2.4.1有機磷農(nóng)藥廣譜降解能力的研究。選擇甲胺磷、胺硫磷、甲拌磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷、甲基嘧啶磷、對硫磷、氯吡硫磷(毒死蜱)9種常見的有機磷農(nóng)藥，分別與營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制成1 g/L的液體選擇培養(yǎng)基，采用“1.2.3”復(fù)篩方法研究復(fù)篩獲得的菌株對9種有機磷農(nóng)藥的廣譜降解能力。

1.2.4.2菌種降解能力的遺傳穩(wěn)定性研究。對復(fù)篩獲得的菌種進行傳代培養(yǎng)，采用“1.2.3”復(fù)篩方法分別測定初始菌株(F0)、第5代菌株(F5)和第10代菌株(F10)對氧化樂果的降解能力，確定菌種對有機磷農(nóng)藥降解能力的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 有機磷農(nóng)藥降解菌的分類鑒定。

1.2.5.1菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)觀察。將篩選獲得的有機磷農(nóng)藥高效降解菌涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)。采用結(jié)晶紫對其細(xì)胞進行染色，觀察菌種的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.5.2生理生化鑒定。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果，按《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]上的鑒定指標(biāo)對降解菌進行生理生化鑒定。

1.2.5.3分子鑒定。采用16S rDNA的方法對有機磷農(nóng)藥高效降解菌進行分子鑒定，設(shè)計的引物為5′-AGAGTTTATCTGCCG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGATT-3′。采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取降解菌基因組，并進行PCR試驗，PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，純化產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(1.4%瓊脂糖)驗證，并送生工生物工程(上海)有限公司測序，將測序結(jié)果與序列庫進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1初篩結(jié)果通過對樣本中菌種的分離和純化，共獲得25株可在含有1 g/L氧化樂果的選擇培養(yǎng)基中生長的菌株，將其依次編號為JWDP-01～JWDP-25。再經(jīng)過生長繁殖能力及水解圈大小的測定，發(fā)現(xiàn)JWDP-05、JWDP-09、JWDP-10、JWDP-16、JWDP-24 5株菌對氧化樂果的耐藥性較強，在含藥的選擇培養(yǎng)基上可產(chǎn)生較大的水解圈，同時OD600值也明顯大于其他菌株(表1)，表明其生長繁殖能力較高。因此，選用該5株菌作為復(fù)篩的出發(fā)菌株，測定其對氧化樂果的降解能力。

2.2復(fù)篩結(jié)果由圖2可知，與對照組相比，初篩分離到的JWDP-05、JWDP-09、JWDP-10、JWDP-16、JWDP-24 5株菌對氧化樂果的降解能力有大幅提高，表明其對有機磷農(nóng)藥均有一定的降解作用，其中以JWDP-09和JWDP-16最突出，因此，選用JWDP-09和JWDP-16作為進一步研究的菌種，對菌株的有機磷農(nóng)藥降解特性進行研究。

2.3菌種有機磷農(nóng)藥降解特性的研究結(jié)果

2.3.1廣譜降解能力。由表2可知，JWDP-16菌株對9種不同的有機磷農(nóng)藥均有良好的降解作用，降解能力表現(xiàn)為更好的廣譜性，而JWDP-09菌株對敵敵畏、甲基嘧啶磷和對硫磷幾乎無降解作用，對其他幾種有機磷農(nóng)藥的降解能力也普遍弱于JWDP-16菌株。

表1　初篩結(jié)果

圖2　復(fù)篩結(jié)果

有機磷農(nóng)藥種類校正農(nóng)藥降解率*∥%JWDP-09JWDP-16甲胺磷40.0233.95水胺硫磷31.1340.21甲拌磷12.8836.46敵敵畏3.4521.63敵百蟲10.5618.77二嗪磷27.9861.09甲基嘧啶磷0.2627.45對硫磷1.4538.04氯吡硫磷(毒死蜱)50.6746.67

注：*校正農(nóng)藥降解率=(處理組農(nóng)藥降解率-對照組農(nóng)藥降解率)/(1-對照組農(nóng)藥降解率)×100%。

2.3.2降解能力的遺傳穩(wěn)定性。由表3可知，JWDP-09和JWDP-16 2株菌分別經(jīng)過5代次和10代次的傳代培養(yǎng)后，對有機磷農(nóng)藥的降解能力均表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。綜合該2株菌對有機磷農(nóng)藥的廣譜降解能力與遺傳穩(wěn)定性，確定JWDP-16菌株為進一步研究發(fā)酵及生產(chǎn)的出發(fā)菌株，并對其進行分類鑒定。

表3　 有機磷農(nóng)藥降解能力的遺傳穩(wěn)定性

2.4降解菌JWDP-16的分類鑒定結(jié)果

2.4.1 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)的觀察。結(jié)果表明，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，JWDP-16菌落直徑達(dá)到0.5～0.8 cm，乳白色，不透明，有臍狀突出，迎光觀察呈白蠟狀，邊緣不整齊，有褶皺。顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示：經(jīng)過結(jié)晶紫染色后，JWDP-16為長桿狀，長2.5～3.5 μm，寬0.8～0.9 μm，以成對或鏈狀排列，有明顯的橢圓形芽孢，芽孢中生或次端生，無莢膜。根據(jù)觀察結(jié)果初步確定該菌種為芽孢桿菌類菌株。

2.4.2 生理生化鑒定結(jié)果。根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果(表4)，對比細(xì)菌鑒定手冊上的指標(biāo)，初步判斷JWDP-16為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

表4　JWDP-16菌株生理生化試驗鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性反應(yīng);“-”表示陰性反應(yīng)。

2.4.3 分子鑒定結(jié)果。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，獲得1 400～1 600 bp長度的基因序列(圖3)。將PCR產(chǎn)物純化后進行測序，結(jié)果表明該基因序列的長度為1 533 bp。將序列在NCBI上進行比對，證實JWDP-16菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并構(gòu)建了相應(yīng)的發(fā)育樹(圖4)。

注：M. DNA Marker; 1、2. JWDP-16菌株。圖3　 JWDP-16菌株的16S rDNA電泳圖譜

圖4　 JWDP-16菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

該研究表明，在農(nóng)藥廠、果園、蔬菜地等經(jīng)常接觸有機磷農(nóng)藥的地區(qū)采集到56份樣本，從中篩選到25株農(nóng)藥降解菌，其中JWDP-16菌株對有機磷農(nóng)藥氧化樂果的降解能力最強，培養(yǎng)72 h的最高降解率達(dá)到59.80%。通過對JWDP-16菌株降解特性的研究表明，該菌對甲胺磷、水胺硫磷、甲拌磷等9種有機磷農(nóng)藥具有良好的廣譜降解能力。同時傳代試驗表明，第5代、第10代與初始菌株間的降解能力無明顯差異，表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過多步鑒定，確定JWDP-16菌株為枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌具有生長繁殖能力強、易于工業(yè)化生產(chǎn)、抗逆性強、易于在土壤中生存、對人畜及環(huán)境無害等特點，一直以來是微生物領(lǐng)域研究和應(yīng)用的重點。

由于微生物在生長繁殖能力方面的優(yōu)勢，使得微生物降解農(nóng)藥技術(shù)成為解決農(nóng)藥降解問題的關(guān)鍵手段[15]。段海明[16]研究表明從有機磷農(nóng)藥及土壤樣本中分離到的3株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)對有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷、毒死蜱和三唑磷均具有良好的降解效果；楊慧[17]從有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)車間土壤中分離到2株對氧化樂果具有降解能力的菌株，一株為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，另一株為氣球菌屬(Aerococcussp.)。可見，在有機磷農(nóng)藥污染嚴(yán)重的區(qū)域仍有大量微生物存在，這些微生物主要以分解代謝有機磷農(nóng)藥獲得相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量供其生長繁殖，從而達(dá)到降解農(nóng)藥的目的。目前，農(nóng)藥降解菌主要有2種應(yīng)用方式：一是采用固定化技術(shù)，該技術(shù)可以維持較高的生物活性和酶活性[18]。趙仁邦等[19]研究了草酸青霉ZHJ6固定化后對有機磷農(nóng)藥甲胺磷的降解作用，結(jié)果表明降解率從原來的60%提高到70%。二是制成性質(zhì)穩(wěn)定的微生物菌劑，該方法主要是將微生物菌體與惰性載體進行混合造粒。王連祥等[20]利用枯草芽孢桿菌制成的復(fù)合微生物菌劑研究對農(nóng)藥的降解作用，結(jié)果表明該微生物菌劑對土壤使用3 d后，農(nóng)藥降解率最高達(dá)90%以上。同時將可降解農(nóng)藥的微生物菌種與能解磷解鉀、固氮等作用的土壤功能性菌種進行結(jié)合，制成具有多種功能的復(fù)合微生物菌劑，也是農(nóng)用微生物菌劑開發(fā)的一個重要研究方向。該研究通過篩選對有機磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，獲得1株可高效降解有機磷農(nóng)藥的菌株JWDP-16，并確定其為枯草芽孢桿菌，為微生物菌劑開發(fā)提供了材料。

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Screening and Identification of Microorganisms with High Performance of Organophosphorus Pesticides Degrading

ZHANG Liu-liu1,2, XIA Sen-yu2, DING Ya-xin3et al (1. Jiangsu Institute of Microbiology Co., Ltd, Wuxi, Jiangsu 214000; 2. Jiangsu Nake Biological Engineering Co., Ltd, Xuyi, Jiangsu 211700; 3. Binghu District Bureau of Agriculture and Forestry of Wuxi City, Wuxi, Jiangsu 214000)

Abstract[Objective] To screen out microorganisms with high performance of organophosphorus pesticides degrading. [Method] We collected samples from rich area of organophosphorus pesticides, isolated and identified microorganisms with high performance of organophosphorus pesticides degrading, and studied the strains’ degradation characteristics. [Result] After screening of strains from 56 samples which were collected from soil and water seriously polluted by organophosphorus pesticides, a strain JWDP-16 with high degrading ability was obtained. The stain JWDP-16 had the highest degradation rate of 59.80% to omethoate. Degradation characteristics showed that the strain JWDP-16 had broad spectrum degradation ability for other organophosphorus pesticides, and also had genetic stability. The strain JWDP-16 was identified asBacillussubtilis. [Conclusion] The strain JWDP-16 has high degradation ability of organophosphorus pesticides and is worth further studying.

Key wordsOrganophosphorus pesticides; Microbial degradation; Screening; Strain identification

收稿日期2015-11-25

作者簡介張六六(1973-)，男，江蘇泗洪人，高級工程師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

基金項目江蘇省無錫市農(nóng)業(yè)科技支撐-生物農(nóng)業(yè)技術(shù)專項(309058-916018)。

中圖分類號S 482

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2015)36-212-04