氨基酸對頭霉素C生物合成的影響

李夢茜 張振旺

（河池學院化學與生物工程學院，廣西 宜州 5463000）

頭霉素C是頭霉素類的一種，屬?-內酰胺類抗生素。頭霉素以其對 ?-內酰胺酶（包括青霉素酶和頭孢菌素酶）的優良抗性而引人注目，其原因是在其分子結構 C7 位上存在一個甲氧基[1]，由此，其通常作為生產半合成抗生素（頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢美唑,替莫西林）的原料藥[2,3]。所有自然產生的 ?-內酰胺類抗生素的生物合成都是從三個氨基酸開始的，L-α-氨基己二酸(L-α-aminoadipic acid，α-AAA)，L-半胱氨酸(L-cysteine)和 L-纈氨酸(L-valine)[4]。其中 L-α-氨基己二酸是一個非蛋白質氨基酸，來源于賴氨酸(lysine)的合成途徑(真菌)，也可以由賴氨酸的分解產生（放線菌）[5]。

本研究對頭霉素C發酵過程中氨基酸添加濃度、添加時間、添加方式等進行研究，證明L-α-氨基己二酸和谷氨酸能夠促進產物頭霉素C的生物合成，并確定了較好的添加控制工藝。

1 材料和方法

1.1 菌種

放線菌Streptomyces sp.OFR 1022，本實驗室保藏。

1.2 培養基

種子培養基(%)：葡萄糖 1，蛋白胨1，酵母提取物0.5，自來水配制。

發酵合成培養基(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽餅粉4，燕麥粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自來水配制。各種氨基酸待培養基滅菌后再分別加入。

1.3 培養方法

（1）斜面培養：將保存于牛奶凍干管中的孢子接到茄瓶斜面，37℃恒溫培養5d，從中挑一個豐滿的菌落轉接到另一個斜面，37℃培養5 d。

（2）種子培養：由斜面挖塊接種子培養基，28℃，250 r/min搖床培養48 h。

（3）發酵培養：將種子液接入發酵培養基， 接種量10%，28℃，250r/min 搖床培養144 h(每個配方三個平行樣)后，終止發酵，取適量發酵液于25 ml離心管中，加入等體積的甲醇，振搖混勻20 min后離心(4000 rpm,10 min)，取上清，微孔濾膜過濾后檢測相關參數。

1.4 分析方法

頭霉素C含量測定：采用HPLC 法，Waters液相色譜儀,色譜柱：PLATISILTM ODS 5μ，250×4.6mm，流動相：A相為0.1% TFA(H2O)，B相為0.1% TFA(乙腈)流速 1.0 ml/min，檢測波長254nm，柱溫30℃。

2 實驗結果與分析

2.1 不同濃度的氨基酸對頭霉素C生物合成的影響

頭霉素C發酵開始前，在培養基中預先加入不同量的氨基酸，使其最終濃度分別為0.05% 、0.1% 和0.2%，培養144 h 后測定頭霉素C的含量，結果如圖1，圖2，圖3所示。

圖1 0.05%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖2 0.1%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖3 0.2%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖示數據表明，在添加的氨基酸中，賴氨酸，脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸，可較大程度地提高頭霉素C的生物合成，尤其添加0.1%的L-a-氨基己二酸時，頭霉素C的產量比對照提高了65.3% 。其余的氨基酸對頭霉素C的生物合成無明顯刺激作用，其中DL-蛋氨酸和L-蛋氨酸反而抑制頭霉素C的生物合成，這與Kaglival[6]報道的實驗結果較為一致。

2.2 氨基酸添加方式對頭霉素C生物合成的影響

上述實驗證實，在培養基中預先加入濃度為0.1%的脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸可顯著地促進頭霉素 C的生物合成。根據經驗預測，如果在發酵過程中采用中間補料的方式，可能會有更好的效果。因此，本實驗又設計了下列兩種方式來研究添加時機與組合添加對頭霉素 C生物合成的影響。由于谷氨酸鈉為谷氨酸的鈉鹽，且價格相對低廉，在接下來的試驗中同時添加了味素（99.9%的谷氨酸鈉）。

2.2.1 不同培養時間補入氨基酸對頭霉素C產量的影響

頭霉素C的分子結構與母核前體L-a-氨基己二酸呈1∶1的摩爾對應關系，假如菌體對前體的利用率能達到 80%，那么只需補入濃度為0.2%的前體，產物頭霉素C的產量即可達到較高單位(計算過程略)。前面實驗結果(Fig.1，Fig.2和Fig.3)表明，當氨基酸加量達到0.1% 時就能取得較好的效果，從而提示對照培養基成分中本來就含有一定量的氨基酸。那么我們就選取濃度為0.1%的氨基酸加量，分別在0 h、48 h和72 h進行補料實驗，培養144 h后測定頭霉素C效價，結果見圖4。

圖4 氨基酸補加時間對頭霉素C生物合成的影響

2.2.2 氨基酸組合添加對頭霉素C生物合成的影響

由以上實驗結果可知脯氨酸，谷氨酸和 α-氨基己二酸在濃度為0.1%，0 h添加最有利于頭霉素C的生物合成，以此為基礎，我們考察了三種氨基酸的組合作用。因此選取組合后濃度為0.1%，0 h時將三者組合添加，實驗結果如圖5 所示，由結果可知，三種氨基酸的組合作用不顯著。

圖5 氨基酸組合添加對頭霉素C生物合成的影響

2.2.3 前體組合添加對頭霉素C生物合成的影響

由于L-α-氨基己二酸（α-AAA), L-半胱氨酸（L-Cys）和L-纈氨酸（L-Val）為頭霉素 C生物合成的前體，2.1試驗已證實單獨添加L-Cys 和L-Val并不能提高頭霉素C的產量，但是，三者的組合添加或許會對產素有一定的幫助，因此選取組合后的濃度為0.1%，0 h時將三者組合添加，實驗結果如圖6 所示，由結果可知，三種前體的組合作用并不明顯。

圖6 前體組合添加對頭霉素C生物合成的影響

在前期研究的基礎上，綜合上述研究結果我們獲得了發酵生產頭霉素C的較優的培養基配方(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽餅粉 4，燕麥粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05,MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自來水配制，0.1%的 α-氨基己二酸(價格昂貴)或谷氨酸(價格低廉)待培養基滅菌后加入。對優化后的發酵培養基條件進行驗證實驗，共三批，結果0 h時添加0.1% 的α-氨基己二酸，平均效價為3869.4 μg/ml，比對照(2386.1 μg/ml)高出62.2%。其次為0 h 時添加0.1% 的谷氨酸(或谷氨酸鈉)，平均產素效價為3421.6 μg/ml，比對照高出43.4%。

3 討論

在頭霉素C類抗生素的生物合成過程中，異青霉素N(IPN)的合成被認為是限制性因素，它直接關系到抗生素產量的高低。添加脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸(或谷氨酸鈉)能夠提高頭霉素C的產量，我們不難發現這幾種物質的分子結構很相似，脯氨酸水解后變為谷氨酸，谷氨酸化學名稱又稱為a-氨基戊二酸，他們的作用可能與a-氨基己二酸相似，直接參與異青霉素N(IPN)的合成。參與?-內酰胺環合成的還有L-半胱氨酸和L-纈氨酸，但試驗中兩者的添加并未提高頭霉素 C的產量，其原因正在研究當中。氨基酸添加時機為0h時對產素的刺激最大，其根本原因可能在于中間補料時對搖瓶的發酵環境造成了不同程度的影響。在合成培養基中加入的不同氨基酸，它們似乎是以各自不同的方式影響頭霉素C 的生物合成，這些氨基酸可能具有前體、誘導物和發育調節劑等一種或多種作用而影響頭霉素C的合成。

[1]Kamogashira T, Nishida T, Sugawara M, et al. Process for the production of antibiotic Cephamycin C:US,4332891[P].1982-06-01.

[2]Omstead DR,Hunt GH, Buckland BC.Comprehensive biotechnology[M].New Jersey: Pergamon Press,1985.

[3]Goldstein EJC, Citron DM.Annual incidence, epidemiology,and comparative in vitro susceptibilities to cefoxitin,cefotetan,cefmetazole,and ceftizoxime of recent communityacquired isolates of the Bacteroides fragilis J Clin Microbiol[J].1988,(26):2361-2366.

[4]Carla AL, Andre PC,Maria LGCA. Enhancing effect of lysine combined with other compounds on cephamycin C production in Streptomyces clavuligerus. B M C Microbiology[J].2013,(13):296.

[5]Pérez-Llarena FJ, Rodríguez-García A, Enguita FJ, Martín JF,Liras P. The pcd gene encoding piperideine-6- carboxylate dehydrogenase involved in biosynthesis of alpha-aminoadipic acid is located in the cephamycin cluster of Streptomyces clavuligerus. J Bacteriol[J].1998,(180):4753-4756.

[6]Lalit D, Kagliwal S A, Survase R S. Singhal. Sequential optimization of production of cephamycin C using Nocardia lactamdurans: effect of nutritional supplements,metablic precursors and inducers,Curent Trends in Biotechnology pharmacy[J].2011,5(3):1325-1337.