Bmi1基因在胰腺癌中的表達及其臨床意義

李　慧, 賀恒鵬, 于雯婷, 崔吉香

(中國醫科大學附屬第四醫院, 1. 輸血科; 2. 檢驗科, 遼寧 沈陽, 110032)

Bmi1基因在胰腺癌中的表達及其臨床意義

李慧1, 賀恒鵬2, 于雯婷1, 崔吉香1

(中國醫科大學附屬第四醫院, 1. 輸血科; 2. 檢驗科, 遼寧 沈陽, 110032)

摘要:目的探討Bmi1基因在胰腺癌及癌旁組織中的表達。方法選取胰腺癌患者的病理組織86例，癌旁正常組織80例。應用半定量 RT-PCR法檢測Bmi1基因mRNA表達情況，分析其與臨床病理特征及預后的關系。結果與癌旁組織相比較，Bmi1基因mRNA在胰腺癌中的表達明顯升高。Bmi1基因mRNA的表達與患者的年齡、性別和分化程度無關，而與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移以及術后3年生存率有關(P=0.019、0.006、0.002)。結論Bmi1基因mRNA的含量高低與胰腺癌的發生、發展有顯著相關性。

關鍵詞:Bmi1; 胰腺癌; RT-PCR; 臨床意義

胰腺導管腺癌(PDAC)是一種常見的惡性腫瘤，其發病率有明顯增高的趨勢，90%的病人在診斷后1年內死亡，5年生存率不到5%[1]。因此，探索相關的指標以指導早期診斷、治療、評估預后、改善患者的生存質量是非常必要的。

Bmi1基因被認為是C-MYC原癌基因的協同基因，在人類許多腫瘤，如霍奇金淋巴瘤、食管癌、乳腺癌、前列腺癌等的發生和發展都和Bmi1的過量表達有關，提示Bmi1基因在研究腫瘤的發病機制和治療等方面有著重大的臨床意義[2-5]。最近的研究[6-7]表明，Bmi1基因在PDAC中也呈現出高表達，但其在PDAC的臨床意義及具體功能尚不十分清楚。該實驗主要通過RT-PCR的方法，研究Bmi1基因在PDAC中的表達，分析其與患者臨床病理參數以及預后的關系，探討Bmi1基因與PDAC生物學行為的相關性以及可能的發病機制，為臨床對PDAC的早期診斷和治療提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1　RNA的提取及反轉錄

① 從之前保存在-80 ℃冰箱中取出組織塊重量約100 mg, 放在EP管中后用一次性研磨棒輕輕研磨至勻漿狀，加入1 mL Tlrizol試劑，室溫靜置5 min; ② 加入200 μL氯仿，振蕩15 s, 室溫靜置5 min, 在低溫高速離心機以4 ℃、12 000 r/min離心15 min; ③ 吸取上層液體轉至另一新 EP管中，加入500 μL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min, 4 ℃、12 000 r/min離心10 min; ④ 棄上清，加入1 mL 75%乙醇，置于4 ℃、10 000 r/min離心5 min, 棄上清; ⑤ 加入DEPC處理后的水20～40 μL, 經反復吹打溶解RNA; ⑥ 取2 μL抽提的RNA加入98 μL 0.1%DEPC滅活RNA酶的去離子水中; ⑦ 用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，cDNA可直接用于PCR擴增。

1.2　RT-PCR擴增反應

引物的設計與合成。參照Genbank中注冊的Bmi1基因序列，用Primer5.0軟件進行分析設計PCR引物，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列及片段長度如表1所示。

表1　引物序列

PCR擴增反應。PCR反應體系25 μL, 具體如下: dNTP 2.0 μL, Bmi1上下游引物各1.0 μL, GAPDH上下游引物各1.0 μL, Taq聚合酶、0.15 μL, cDNA 1.0 μL。反應條件為: 94 ℃變性45 s, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸60 s, 共35個循環，結束后再72℃總延伸10 min。

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳及結果判定。PCR產物以15 g/L制備1.5%的瓊脂糖凝膠，加5μL PCR產物，并設定電泳參數為110 mV電壓、45 min。經凝膠圖像分析儀分析電泳條帶亮度并拍照，用QuatityOne軟件進行灰度值的比較。以GAPDH作為內參照，計算記錄Bmi1基因mRNA的相對表達量。

1.3　組織標本的收集

研究對象為中國醫科大學附屬第四醫院2011年10月—2014年1月有完整病例資料的PDAC患者的病理組織86例，每例患者手術取切除的PDAC組織，同時取其離癌組織邊緣2 cm以上的癌旁組織80例，且病理證實無癌細胞浸潤。詳細記錄病人的性別，年齡及臨床特征，患者在手術前未進行任何的放療或化療等抗癌治療。

1.4　數據處理

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行統計學分析，半定量RT-PCR結果選用t檢驗分析，計數資料采用χ2檢驗，患者預后分析采用kaplan-meier法，logistic-rank進行檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1　Bmi1基因mRNA在PDAC中的表達情況

對RT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，Bmi1基因和GAPDH內參基因共同擴增后，PDAC Bmi1基因mRNA條帶亮度明顯高于癌旁組織。經凝膠圖像分析儀分析電泳條帶亮度并進行灰度值結果顯示，Bmi1基因mRNA在PDAC組織中為(1.58±0.49), 與癌旁組織的(0.31±0.23)相比較，差異有統計學意義(P<0.0001)。

2.2　Bmi1的表達與PDAC患者臨床病理特征之間的關系

將86例PDAC的Bmi1基因平均表達值作為cut-off值，將Bmi1基因的含量分為高表達組和低表達組，其中高表達組45例，低表達組41例，分析其與PDAC臨床病理特征之間的關系。結果發現Bmi1基因mRNA的表達與患者的年齡、性別及分化程度無關(P>0.05); 而與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移有關，差異具有統計學意義(P<0.05), 見表2。

表2　Bmi1蛋白表達與PDAC患者臨床病理特征的關系

2.3　Bmi1 mRNA的表達與預后的關系

運用Kalpan-meier生存分析Bmi1 mRNA表達與PDAC患者術后3年隨訪存活率的關系，Bmi1mRNA高表達者生存時間更短[χ2=9.156,P=0.002, 中位生存時間分別為(17.0±5.01)月、(25.0±1.99)月]; 說明Bmi1mRNA表達上調影響患者的預后。

3討論

PcG家族最初是在果蠅體內作為同源盒基因(Hox)的抑制因子被鑒定和發現，PcG蛋白通過形成巨大的多目標復合物，作用在染色體上的不同位點，致使染色體變構，調控基因的表達[8]。Bmi1基因是第一個被鑒定的PcG家族基因，人Bmi1基因位于人10號染色體短臂1區3帶(10p13)，該區主要與惡性淋巴瘤和兒童白血病的染色體移位有關。在動物模型和體外模型中，Bmi1能引起細胞的轉化和促進腫瘤的生長[9]。

Bmi1通過與c-Myc蛋白共同作用抑制INK4a/ARF基因位點，由于不同的閱讀順序，INK4a/ARF編碼2種不同結構的蛋白的表達p16ink4a和p19 arf。p16ink4a是一個周期性依賴蛋白激酶抑制因子，可以抑制周期蛋白D-CDK4/6復合物的形成，激活Rb信號通路，抑制細胞增殖; p19ink4a可以通過抑制MDM2誘導p53信號通路，阻止細胞周期停滯和細胞凋亡，因此當Bmi1基因高表達時，通過抑制 p16ink4a和p19 arf，從而促進細胞增殖、阻止細胞凋亡[10]。

在本實驗中，作者通過對Bmi1基因在PDAC中的表達情況進行研究，用RT-PCR的方法測定了Bmi1基因mRNA在PDAC和癌旁組織含量。結果顯示，Bmi1基因mRNA在PDAC組織中的表達明顯高于癌旁組織，含量表達差異具有統計學意義。在以往的研究[6-7]中也表明，與正常組織相比，Bmi1蛋白在PDAC癌中呈高表達，而且在胰腺炎和胰腺上皮內瘤樣病變組織中, Bmi1的表達含量也升高[7], 提示Bmi1的過度表達可能與PDAC的發生有關。

通過分析Bmi1基因mRNA的表達與患者的病理參數之間的關系發現，Bmi1的表達與患者的年齡、性別以及分化無關，差異無統計學意義；而與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移以及術后3年生存率有關，隨著腫瘤浸潤深度加深以及淋巴結轉移，Bmi1基因的表達含量也隨之升高，提示Bmi1的過度表達可能與PDAC惡性程度高和預后不良有關。在急性髓性白血病、食管癌患者中，Bmi1蛋白陽性表達者的生存時間明顯比Bmi1蛋白陰性表達者生存時間明顯縮短[11-12]。以上的研究表明，Bmi1可能作為一種癌基因與PDAC的發展及預后有關，具有重要的臨床意義。

通過上述研究, Bmi1作為一種癌基因與PDAC的發生、發展及預后密切相關，但目前其分子發病機制還未完全闡明，是否可將其作為PDAC分子治療的新靶點，將是未來需要研究的方向。

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Expression of Bmi1 gene in pancreatic cancer

and its clinical significance

LI Hui1, HE Hengpeng2, YU Wenting1, CUI Jixiang1

(1.Departmentofbloodtransfusion; 2.LaboratoryDepartment,TheFourthAffiliated

HospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang,Liaoning, 110032)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of Bmi1 gene in pancreatic cancer and adjacent tumor tissues. MethodsTissues of 86 cases of pancreatic cancer and 80 cases of adjacent tumor tissues were selected. Semi-quantitative RT-PCR was applied to detect the expression of Bmi1 gene mRNA, and its relationship with clinical pathological features and prognosis was analyzed. ResultsCompared to adjacent tumor tissues, Bmi1 mRNA expression level in pancreatic cancer tissues were higher. Bmi1 expression in pancreatic cancer was not correlated with the patient′s age, gender and differentiation (P>0.05), but there were correlations between Bmi1 expression and TNM stage, lymph node metastasis and 3-year survival rate (P=0.019, 0.006, 0.002). ConclusionThe content of Bmi1 gene mRNA is significantly correlated with the incidence, development and prognosis of pancreatic cancer occurrence.

KEYWORDS:Bmi1; pancreatic cancer; RT-PCR; clinical significance

收稿日期:2014-12-25

中圖分類號:R 735.9

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)11-040-03

DOI:10.7619/jcmp.201511012