桑枝枯病病原菌培養性狀測定

毛建萍唐曉麗浦冠勤顧海洋賁瑞生石根祥

（1.蘇州大學蠶桑研究所；2.蘇州大學金螳螂建筑學院 215123；3.大豐市蠶桑技術指導站；4.大豐市蠶種場）

桑枝枯病病原菌培養性狀測定

毛建萍1，2唐曉麗2浦冠勤1，2顧海洋3，4賁瑞生4石根祥4

（1.蘇州大學蠶桑研究所；2.蘇州大學金螳螂建筑學院 215123；3.大豐市蠶桑技術指導站；4.大豐市蠶種場）

江蘇大豐蠶種場桑園發現一種新的桑樹病害，主要為害桑樹葉片和枝條，造成葉片脫落，嫩梢褐變腐爛，停止向上生長，嚴重影響桑樹生長和桑葉產量。通過組織分離培養獲得一株病原真菌，報告其病原菌的生物學特性和培養性狀測定情況。

桑樹 病蟲害 桑枝枯病

2014年7月，江蘇大豐蠶種場桑園發現一種新的桑樹病害，主要為害桑樹葉片和枝條，造成葉片脫落，嫩梢褐變腐爛，停止向上生長，嚴重影響桑樹生長和桑葉產量。通過組織分離培養獲得一株病原真菌，采用Koch's法則確認其為致病病原［1］，根據發病部位和發病癥狀，暫稱為桑枝枯病。現將其病原菌的生物學特性和培養性狀測定情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑枝枯病病原分離材料采集于大豐蠶種場發病桑園。

1.2 供試培養基［2］

PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

黃豆芽培養基：黃豆芽200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

桑汁培養基：桑葉200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

上述3種培養基配制后，121℃高壓滅菌30min，冷卻后備用。

1.3 病原菌分離培養［2］

在無菌操作條件下用刀片切取病健交界處的病組織少許，將病組織塊先在70%酒精中浸泡消毒1min，然后迅速移入0.1%升汞溶液中表面消毒1.5min，最后用無菌水漂洗3次；用剪刀將消毒后的病組織剪成小塊，分別置于平板培養基表面，放入25℃恒溫箱中培養。待病組織上長出菌絲后，再挑取菌絲在平板培養基上純化獲得單菌落。

1.4 回接確定病原

根據Koch's法則，用無菌水將分離得到的病原菌制作成菌懸液，選取健康桑樹為接種對象。用經過消毒的接種針在桑樹的嫩莖部針刺傷口，然后用無菌脫脂棉蘸取菌懸液包在莖部傷口處，葉片采用摩擦接種，接種的枝條用塑料袋包裹保濕，設三組重復，另用清水接種作對照。接種于傍晚進行，次日清晨取下保濕的塑料袋，然后逐日觀察接種后的發病情況。

1.5 病原菌形態特性觀察

將病原菌接種于PDA平板培養基上，置于25℃恒溫培養箱中培養，逐日觀察記錄其菌絲、菌落以及分生孢子的生長情況和形態特征。

1.6 不同培養基對菌絲生長的影響

選用PDA培養基、黃豆芽培養基和桑葉汁培養基制成平板培養基，將分離純化得到的病原菌用無菌水制成菌懸液，用直徑5mm的無菌濾紙碟浸入菌懸液中蘸取分生孢子，將濾紙碟稍微晾干后放入各平板培養基表面中央處，每處理重復3次，置于25℃恒溫箱中培養7d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑并計算出三組重復的平均值，比較不同培養基對菌絲生長的影響。

1.7 不同溫度對菌絲生長的影響

將預先配制的PDA培養基制成平板，待其冷卻凝固后備用。用滅菌的直徑5mm濾紙碟蘸取預先配制的菌懸液，放于平板培養基中央，每皿一片，培養皿用泊拉膜密封后分別放入5℃、8℃、11℃、14℃、17℃、20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃的恒溫箱中培養，每區設3個重復，培養8d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑，取三組重復的平均值比較不同溫度對菌絲生長的影響。

1.8 不同pH值對菌絲生長的影響

首先配制PDA培養基，用土豆熬煮并過濾出1000mL濾液，加入15g葡萄糖后攪拌均勻后分別量取100mL依次倒入8個燒杯中，利用pH計和磁力攪拌器，用0.1%NaOH和0.1%HCl調節其pH值，分別調整pH值至4、5、6、7、8、9、10、11，然后分別裝入加有1.5g瓊脂粉的三角瓶中高壓滅菌。滅菌后的培養基在無菌操作下制成平板，按照前述方法接種致病真菌，每種pH處理3次重復，放入25℃恒溫箱中培養7d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑，取三組重復平均值比較不同pH值對菌絲生長的影響。

2 結果與分析

2.1 桑枝枯病病害癥狀特點

初時在桑樹葉片上出現黃褐色和黑褐色病斑，多在葉脈間，后病斑相互連接形成大病斑，并逐漸發黑焦枯，葉柄萎蔫，最終脫落；發病初期枝條基本正常，中后期呈水浸狀，芽基部逐漸變色，呈黃褐色至黑褐色，枝條皮層褐變腐爛，頂端生長點發黑腐爛，停止向上生長［3］，見圖1。

圖1 桑枝枯病發病癥狀

2.2 病原菌分離培養及形態特征

桑枝枯病病原菌在PDA培養基上生長速度較快，菌絲體初為白色，后逐漸轉變為灰色、灰黑色至黑色；菌落圓形，平坦不透明，大而疏松，呈絨氈狀，邊緣可見絲狀菌絲；當菌絲體培養一段時間后，在菌落上能形成略突出表面的黑色小點狀子實體［4］（圖2），在顯微鏡下可見橢圓形灰色分生孢子，分生孢子單胞（圖3）。

2.3 病原菌的回接結果

將從新鮮病組織中分離得到的桑枝枯病菌回接到健康桑枝上，3d后接種部位開始發病，并有蔓延之勢，其發病癥狀特點與田間自然發病的病枝相同，清水對照處理區則不發病。將回接得到的病組織以相同方法進行病原菌的分離培養，獲得的病原菌與從田間自然發病組織分離得到的病原菌形態一致，從而可以確定該真菌即為桑枝枯病的致病病原菌。

圖2 桑枝枯病菌菌絲體和子實體

圖3 桑枝枯病病原分生孢子

2.4 不同培養基對菌絲生長的影響

測定結果表明，病原菌在PDA、黃豆芽培養基及桑葉汁培養基上均能良好生長，但菌絲在PDA培養基上生長速度最快，培養7d后菌落直徑為74.33mm，平均生長量為11.39mm／d，桑葉汁培養基次之，7d后菌落直徑和平均生長量分別為70.50mm和10.92mm／d，黃豆芽培養基培養效果與桑葉汁培養基大致相同，分別為70.00mm和10.72mm／d。可見，PDA培養基作為真菌常用培養基，其物質成分確實能夠滿足絕大多數真菌的生長需要。

2.5 不同溫度條件對菌絲生長的影響

研究結果表明：該菌在5～35℃的11個梯度溫度中均能生長，但各溫度梯度之間的生長情況有明顯差異（見圖4）。在生長溫度范圍內，隨著溫度的升高菌絲生長速度逐漸加快，在26～29℃之間達到頂峰后長速回落。長速最快的溫度條件為26、29℃，培養第6天就長滿了整個平板培養基（直徑90mm），日平均生長量分別為16mm／d和17mm／d；在26℃之前隨著溫度的升高，菌絲生長速度逐漸加快，而在29℃之后，則隨溫度升高而菌絲生長速度趨慢，38℃條件下則菌絲不能生長（持續觀察15d）。可見，該菌的可生長溫度范圍有明顯的適宜生長曲線，最適生長溫度范圍為26～29℃。

圖4 不同溫度下桑枝枯病菌日平均生長速度

2.6 不同pH值條件對菌絲生長的影響

測定結果表明：該菌對pH值的適應范圍較廣，在pH值為4～11的范圍內均能很好生長，最適生長pH值為6～7之間，培養一周后菌落直徑為79.67mm左右，日平均生長量為11.53～11.61mm／d；pH為11時生長相對較慢，菌落直徑為60.33mm，日平均生長量為8.44mm／d。如圖5所示，在pH4～11的范圍內，隨著pH值的升高，菌絲生長速度緩慢增加，在pH接近7時長速達到最大值后又緩慢減弱，pH值大于10后日平均生長速度明顯變慢，低于10.17mm／d。通過對菌落形態的觀察發現，pH值為4的條件下菌落相對較薄，其他pH值間無明顯差別。

圖5 不同pH值下桑枝枯病菌菌絲日平均生長速度

3 小結與討論

通過對桑枝枯病新鮮病組織的分離培養，結合Koch's法則的應用，確認分離獲得的真菌為該病害的致病性病原。根據該病害的發病癥狀與為害特點，初步認為這是一種新的桑樹病害，暫稱為桑枝枯病。由于該病害在田間的發病速度快，對桑樹生長和桑葉產量的影響很大，應該引起有關部門的足夠重視。

病原菌培養性狀的測定結果表明，該菌適于在PDA培養基上生長，并能在培養基上形成子實體和產生分生孢子。該菌的生長溫度范圍為5～35℃，最適生長溫度范圍在26～29℃之間，菌絲的這一生長特點符合其在夏季高溫下發病危害的實際情況。該菌在pH值4～11范圍內均能良好生長，且培養前期（2d內）菌絲生長量沒有明顯差異，說明該菌對生長pH值條件的適應性較強，其最適生長pH值在6～7之間。

本次試驗僅對病原菌的形態特征以及生物學特性進行了初步研究，但對于該病原菌分類地位的歸屬和病害的發生規律以及綜合防治方法等還有待進一步研究。

［1］ 方中達.植病研究法（第三版）［M］.北京：中國農業出版社，2007.

［2］ 浦冠勤毛建萍，桑枝枯菌核病病原菌生物學特性研究［J］.蠶業科學，202，28（2）：87－90.

［3］ 陸家云.植物病原真菌學［M］.北京：中國農業出版社，2001.

［4］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，1979

S888.71＋3

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2015－08－11－001