吸煙和不同飼養方式對大鼠動脈粥樣硬化的影響

韓婷姣，許建英

吸煙和不同飼養方式對大鼠動脈粥樣硬化的影響

韓婷姣1，許建英2

摘要：目的探討吸煙和不同飼養方式對大鼠動脈粥樣硬化形成的影響及其可能的機制。方法將48只6周齡清潔級雄性SD大鼠按吸煙與否和不同飼養方式隨機分為吸煙正常、高脂和饑餓組及非吸煙正常、高脂和饑餓組，分別給予香煙煙霧或空氣暴露和正常、高脂及饑餓飼養。24周后檢測大鼠Lee’s指數，觀察主動脈粥樣硬化病理學改變，免疫組化法檢測主動脈血管內皮生長因子(VEGF)，酶聯免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯素(APN)水平。結果吸煙影響Lee’s指數，主動脈VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分別為27.710，55.370，47.310，37.405，7.064；P<0.05)。吸煙使Lee’s指數降低，使主動脈VEGF，血清TNF-α和IL-6水平增高。不同飼養方式影響Lee’s指數，主動脈VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分別為95.290，3.915，7.276，9.791，48.877；P<0.05)。吸煙組和非吸煙組內均高脂組Lee’s指數高于正常組和饑餓組，正常組高于饑餓組。吸煙組內：高脂組主動脈VEGF水平高于正常組和饑餓組；高脂組和饑餓組血清TNF-α和IL-6水平均高于正常組；高脂組血清APN水平低于正常組和饑餓組，正常組低于饑餓組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對于血清APN，吸煙和不同飼養方式有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂飼養(正常組和饑餓組)大鼠，吸煙使血清APN水平升高；高脂組大鼠，吸煙使血清APN水平降低。吸煙組主動脈VEGF與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關(r值分別為0.471，0.448；P<0.05)。鏡下觀察主動脈，發現非吸煙組無動脈粥樣硬化發生，吸煙組可見早期動脈粥樣硬化改變。結論吸煙和不同飼養方式均可影響動脈粥樣硬化形成，吸煙且高脂飼養狀態動脈粥樣硬化最顯著，系統性炎癥反應可能參與其中。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；飼養方式；吸煙

動脈粥樣硬化是多種心血管系統疾病的基本病理改變，且是一種復雜的炎性病變疾病，有多種因素共同參與[1]，包括遺傳、年齡、性別等不可控因素和飲食習慣、吸煙、肥胖、高脂血癥、高血壓等可控因素，而其確切發病機制尚不明確，可能有血管內皮細胞功能紊亂、炎癥反應、氧化應激、血脂代謝異常等機制參與其中。而當前隨著社會經濟條件的改善，人們飲食結構發生改變，肥胖、吸煙人群增多，動脈粥樣硬化的患病率也逐年增高。因此本實驗擬通過觀察正常、高脂和饑餓飼養的吸煙及非吸煙大鼠動脈粥樣硬化程度及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯素(APN)的水平，探討不同飼養方式和吸煙對動脈粥樣硬化的影響及其可能的機制。

1材料與方法

1.1動物分組和模型建立清潔級健康雄性SD大鼠48只，體質量200 g±20 g，由山西醫科大學動物實驗中心提供；按吸煙與否和不同飼養方式隨機均分為吸煙正常組、吸煙高脂組、吸煙饑餓組、非吸煙正常組、非吸煙高脂組和非吸煙饑餓組。參照文獻[2]自制大鼠實驗性吸煙裝置，卷煙為市場銷售的紅旗渠牌卷煙，焦油含量每支11 mg，煙堿含量每支0.9 mg。吸煙組大鼠于裝置內給予煙霧暴露，每周熏煙6 d，每天上、下午各1次，每次15支，每支香煙點燃15 min后換煙，每次1.5 h。非吸煙組同時放至相同裝置內給予空氣暴露。正常組給予脂肪能量百分比為10%的D12450B普通飼料(100 g體重10 g/d)；高脂組給予脂肪能量百分比為45%的D12451高脂飼料(100 g體重10 g/d)；饑餓組給予脂肪能量百分比為10%的D12450B普通飼料(100 g體重6 g/d)，飼料均購自廣東省醫學實驗動物中心。余飼養條件相同。每周記錄大鼠體重(g)及體長(cm)，以監測大鼠生長狀況。共建造模型24周。

作者單位：1.山西醫科大學第一臨床醫學院(太原 030001)；2.山西醫科大學附屬山西大醫院

1.2Lee’s指數測定24周后腹腔注射麻醉大鼠，測量其體重(g)及體長(cm)(大鼠鼻尖至肛門的距離)，計算Lee’s指數=(體重×1 000)1/3/體長。

1.3血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯素(APN)檢測腹主動脈采血，離心，分裝血清，-80 ℃凍存。用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定血清TNF-α、IL-6和APN水平(APN試劑盒購自美國R&D生物科技有限公司，TNF-α和IL-6試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司)。

1.4主動脈病理學分析及VEGF測定取主動脈根至胸主動脈血管，同上述步驟制成HE染色切片。觀察主動脈病理學改變。采用改良鏈酶親和素-生物素-過氧化物霉復合物(SABC)法檢測主動脈VEGF水平。試劑，一抗：VEGF兔抗大鼠多克隆抗體(1∶150稀釋)；二抗：SABC免疫組化染色試劑盒DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。基本步驟：上述蠟塊同步制成帶電荷切片，常規脫蠟至水，過氧化氫10 min，抗原修復，封閉，先后加一抗、二抗及SABC、DAB顯色劑。陽性結果為細胞質棕黃色。每只大鼠取1個切片，每張切片×400下隨機選取5個視野進行圖像采集，用Image-Pro Plus 6.0軟件處理分析，計算平均積分光密度(積分光密度/面積)。

2結果

2.1Lee’s指數析因分析及各組比較吸煙和不同飼養方式均影響Lee’s指數水平(F值分別為27.710，95.290；P<0.05)，兩者間無交互作用(F=0.455，P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，Lee’s指數降低。吸煙組和非吸煙組內均高脂組Lee’s指數高于正常組和饑餓組，正常組高于饑餓組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、表2。

表1　各指標析因分析結果

表2　6組各指標的比較(±s)

2.2主動脈病理學改變和VEGF水平析因分析鏡下發現非吸煙組無動脈粥樣硬化發生，內皮細胞結構完整，無增生，層次較為清楚；吸煙組可見早期動脈粥樣硬化改變，內皮細胞水腫，平滑肌細胞遷移和增生。吸煙和不同飼養方式均影響主動脈VEGF水平(F值分別為55.370，3.951；P<0.05)，兩者間無交互作用(F=1.261，P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，主動脈VEGF水平增高。吸煙組內高脂組主動脈VEGF水平高于正常組和饑餓組，差異均有統計學意義(P>0.05)。吸煙組內正常組和饑餓組主動脈VEGF表達水平、非吸煙組內3組主動脈VEGF表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1、表2。

2.3血清TNF-α和IL-6水平析因分析吸煙和不同飼養方式均影響血清TNF-α和IL-6水平(F值分別為47.310，7.276，37.405，9.791，P<0.05)，兩者間均無交互作用(F值分別為0.413，0.499；P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，血清TNF-α和IL-6水平增高。吸煙組內高脂組和饑餓組血清TNF-α和IL-6水平均高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)，高脂組與饑餓組差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1、表2。

2.4血清APN水平析因分析吸煙和不同飼養方式均影響血清APN水平(F值分別為7.064，48.877；P<0.05)，兩者間有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂飼養(正常組和饑餓組)大鼠吸煙使血清APN水平升高，高脂組大鼠吸煙使血清APN水平降低。吸煙組內高脂組血清APN水平低于正常組和饑餓組，正常組低于饑餓組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、表2。

2.5吸煙組各因子相關性分析吸煙組主動脈VEGF與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關(r值分別為0.471，0.448；P<0.05)。

3討論

本研究通過分析各組大鼠Lee’s指數水平，發現不同飼養方式影響Lee’s指數，吸煙及非吸煙大鼠均為高脂飼養狀態Lee’s指數最高和饑餓飼養狀態Lee’s指數最低。并觀察了各組大鼠主動脈病理學改變，發現吸煙大鼠主動脈有早期動脈粥樣硬化改變。Celletti等[3]研究表明VEGF可促進動脈粥樣硬化進展的速度和程度，本研究發現吸煙和不同飼養方式均影響大鼠主動脈VEGF，吸煙且高脂飼養大鼠動脈粥樣硬化VEGF水平最高，故吸煙和高脂飼養均可促進動脈粥樣硬化的發生發展。這證實了目前的臨床研究結論，吸煙[4]和肥胖均為冠心病的危險因素。目前關于吸煙和肥胖促進動脈粥樣硬化發生發展的作用機制尚不確切。現認為動脈粥樣硬化是一種炎性病變疾病，本研究推測以上兩因素可能通過炎癥反應參與其中，故進一步觀測了各組大鼠血清TNF-α、IL-6、APN的水平。

本研究發現吸煙使大鼠血清TNF-α和IL-6的水平增高，且吸煙大鼠TNF-α、IL-6與動脈粥樣硬化程度呈正相關。TNF-α[5]和IL-6可通過促進黏附分子分泌、介導內皮細胞損傷、促進血栓形成等途徑促進動脈粥樣硬化的發生發展。故表明吸煙可能通過系統性炎癥反應促進動脈粥樣硬化發生發展。

有研究證實APN具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，低APN血癥是冠心病的獨立危險因素[6]。本研究發現吸煙和不同飼養方式對血清APN影響存在交互作用。吸煙且高脂飼養大鼠血清APN水平較非吸煙且高脂飼養大鼠低，血清TNF-α和IL-6水平較吸煙且正常飼養大鼠高。APN可通過抑制成熟巨噬細胞功能、粒-單系祖細胞的生長、TNF-α在血漿中的濃度等多種途徑發揮抗炎作用，通過保護血管內皮細胞[7]、抑制巨噬細胞對膽固醇酯的攝取[8]、抑制平滑肌細胞增生遷移[9-10]等多種機制發揮抗動脈粥樣硬化作用。故推測吸煙且高脂飼養大鼠可能由于血清APN水平的降低，抗炎、抗動脈粥樣硬化作用減弱，且系統炎癥反應增強，導致動脈粥樣硬化最為顯著。本研究還發現吸煙且饑餓飼養大鼠血清APN、TNF-α和IL-6水平均比吸煙且正常飼養大鼠高，兩組大鼠主動脈VEGF雖差異無統計學意義，但吸煙且饑餓飼養大鼠有增高趨勢。腫瘤疾病厭食惡病質和維持性血液透析消瘦病人炎癥因子顯著升高[11]，故推測上述結果原因為吸煙和饑餓狀態均為系統性炎癥反應增高，而增高的APN尚不足以對抗所致。但尚需進一步的研究予以證實。

綜上所述，本研究結果提示吸煙和不同飼養方式均可影響動脈粥樣硬化形成，吸煙且高脂飼養狀態動脈粥樣硬化最顯著，炎癥反應可能參與其中。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-05-11)

通訊作者：許建英，E-mail：xujyty@126.com

中圖分類號：R543.5R256.2

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．011

文章編號：1672-1349(2015)18-2064-03