硒對病毒性心肌炎小鼠心肌的保護作用及其機制研究

硒對病毒性心肌炎小鼠心肌的保護作用及其機制研究

黎萍，鄭百紅*，潘薇，徐文靜，許忠

(吉林大學第二醫院 兒科， 吉林 長春130041)

病毒性心肌炎(VMC)是小兒心血管系統中最常見疾病。VMC臨床表現輕重不一，部分急性VMC可導致心力衰竭或者嚴重的心律失常，嚴重威脅著兒童的身體健康[1]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)能動員心肌組織中的多能心肌干細胞，并促進其增殖、分化，可補充病理狀態下死亡的心肌細胞[2]。我們前期臨床研究表明，硒可通過清除氧自由基，通過抑制脂質過氧化反應保護病毒性心肌炎小兒的心肌[3]。而硒是否能影響病毒性心肌炎小鼠心肌組織中IGF-1表達目前鮮有報道，本研究將以維生素C干預為對照，闡明硒干預對病毒性心肌炎小鼠的心肌保護作用以及對IGF-1表達的影響。

1材料與方法

1.1病毒及主要試劑

柯薩奇B3病毒(CVB3)的Nancy株由吉林大學基礎醫學院微生物教研室惠贈。本研究中所使用的CVB3半數組織感染量為100 TCID50/0.1 ml，-80℃保存備用。亞硒酸鈉片為北京曙光藥業有限責任公司生產，維生素 C為東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產。小鼠IGF-1的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；兔抗小鼠IGF-1多克隆一抗為Bioworld 公司產品，組織裂解液和蛋白濃度測定試劑盒、HRP 標記的二抗均為上海碧云天公司產品。

1.2實驗動物及分組

80只4周齡BALB/c雄性小鼠，隨機分為4組：①正常對照(n=20)：連續3天腹腔注射不含病毒的培養液200 μl；②病毒對照組(n=20)：腹腔注射100 TCID50CVB3病毒液200 μl；連續3天；③維生素C對照組(n=20)：自接種病毒液當日(記為第0天)開始，給予200 mg·kg-1d-1的維生素C灌胃；④硒干預組(n=20)：亞硒酸鈉， 劑量為 100 μg/kg ，每日1次。各組連續處理14天，并于第15天分別眼球后取血后斷頸處死，同時取心臟，沿心縱軸眼科剪切開心臟，一半10%甲醛固定，待蘇木素-伊紅染色后行病理學檢查，另外二分之一置于-80℃冰箱凍存。

1.3病理學檢查

常規制作病理切片，經過蘇木素-伊紅染色后，在光鏡下，每張切片隨機取5個視野，心肌病變面積的計算公式為每個高倍視野中炎性細胞浸潤及壞死區域面積占整個視野面積的百分比，并依此判斷心肌病理變化程度。無病變0分；病變面積小于25%記為1分，25%-50%記為2分，50%-75%記為3分；大于75%記為4分；最后計算心肌病變積分。

1.4ELISA法檢測小鼠血清IGF-1水平

本研究采用美國Bio-tek，Instruments有限公司生產的ELX-800酶標儀、卡爾文生物科技有限公司生產的試劑盒檢測小鼠血清IGF-1，比較各組間的IGF-1水平差異。

1.5Western blot 檢測

采用組織裂解液裂解心肌組織，蛋白定量后，取30 μg總蛋白上樣，電泳，濕轉法轉膜，封閉后，用封閉液1∶400稀釋相應一抗后浸泡膜，洗膜，用封閉液1∶5000稀釋相應的HRP標記的二抗后浸泡膜，ECL顯影，以GIS數碼凝膠成像系統分析蛋白雜交帶光密度，IGF-1/β-actin代表IGF-1的相對表達量。

1.6數據分析

2結果

2．1小鼠生存率比較

實驗無意外死亡。正常組小鼠狀態良好，無死亡；病毒對照組小鼠第3天出現毛蜷縮，進食減少，激惹，體重增加緩慢，第6、7天分別死亡1只，第8天、第9天分別死亡1只，第12天、第13天分別死亡2只，14天生存率60.0%(12/20)。維生素C以及硒干預組小鼠14d生存率分別為80.0%(16/20)、 85.0%(17/20)。與病毒對照組比較，維生素C以及硒干預組生存率明顯提高，有統計學差異(P<0.05)，維生素C對照組和硒干預組之間生存率無統計學差異(P>0.05)。

2.2心肌組織病理學改變

維生素C、硒干預組及病毒對照組小鼠心肌組織可見炎性細胞浸潤，心肌纖維斷裂和局灶性壞死，其中病毒對照組可見炎性細胞浸潤呈片狀及彌漫性，心肌纖維斷裂和局灶性壞死，維生素C、硒干預組病變較病毒對照組輕，炎性細胞浸潤少，壞死灶小且減少，如表1所示，組間差異有統計學意義(P<0.05)；而后兩組之間無統計學差異(P>0.05)。正常對照組小鼠心肌組織未見明顯病變。

表1　各組小鼠心肌病理積分及心臟重/體重比變化

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

2.3小鼠血清IGF-1水平檢測

不同組別之間IGF-1水平詳細數據見表2，可見病毒對照組小鼠的IGF-1水平顯著低于正常對照組；維生素C對照組與硒干預組IGF-1水平顯著高于病毒對照組，見表2。

表2　各組小鼠血清IGF-1水平

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

2.4Western blot法檢測各組心肌IGF-1表達

圖1為各組小鼠心肌組織的IGF-1蛋白電泳圖，表3為IGF-1相對表達量及分析。與正常對照組相比，其他3組IGF-1表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)；維生素C、硒干預組間IGF-1表達無顯著差異(P>0.05)；與維生素C、硒干預組相比，病毒對照組的IGF-1表達明顯降低，有統計學意義(P<0.05)。

3討論

CVB3感染所致VMC在兒科臨床較為常見，其發病機制主要包括：CVB3的直接毒性作用，機體的免疫反應以及氧化作用等[4]。嚴重的急性VMC可導致心力衰竭或嚴重的心律失常，是小兒猝死的重要原因之一；部分患兒可發展成為慢性心肌炎，甚至進展為擴張型心肌病[5]。VMC也成為兒童后天性心臟病的主要病因，嚴重威脅著小兒的身體健康。

圖1　各組小鼠心肌IGF-1蛋白電泳圖

組別IGF-1正常對照組0.93±0.02 病毒對照組0.21±0.05△維生素C對照組0.62±0.15*硒干預組0.56±0.21*F9.34P<0.001

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

本研究表明，病毒對照組小鼠的心肌組織具有典型的病毒性心肌炎病理改變，而心肌IGF-1表達水平較正常對照組顯著降低，提示IGF-1與病毒性心肌炎的發展有關。IGF-1高表達對心血管系統具保護作用。IGF-1作為一種高效生長因子，可促進心肌細胞DNA合成。研究表明，IGF-1高表達能通過提高一氧化氮合酶活性，發揮促進自由基清除、擴血管及干細胞動員等作用，還能通過抗心肌細胞凋亡作用及激活K+通道開放減少缺血再灌注損傷，發揮保護缺血性梗死心肌的作用[6]，另外，低IGF-1水平是心血管疾病一個獨立危險因子，可增加心源性死亡的風險[2]。本研究表明，小鼠感染CVB3后，IGF-1表達下降；給予維生素C或者硒可使心肌細胞的IGF-1升高，減少心肌受損。

研究表明，硒能促進細胞再生，抗感染，清除自由基，改善心肌功能等多種生物活性[3，7]。本研究中硒干預組VMC小鼠與維生素C對照組比較，結果顯示與病毒對照組相比，維生素C、硒干預組心肌病理改變均明顯減輕，IGF-1表達均增加，有統計學差異。本研究維生素C、硒干預組間差異無統計學意義；提示硒對VMC心肌細胞具有保護作用。本研究結果顯示，硒通過上調病毒性心肌炎小鼠的IGF-1表達，發揮了對病毒感染所致心肌損傷的保護作用。IGF-1是生長激素釋放激素-生長激素-IGF-1軸的主要效應分子，硒是否通過該軸發揮心肌保護作用尚待進一步研究證實。

綜上，硒可上調VMC小鼠的IGF-1表達，減輕CVB3病毒感染所導致的心肌損傷，本研究為硒在病毒性心肌炎的臨床應用提供了實驗基礎和科學依據。

參考文獻：

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[2]Troncoso R,Ibarra C,Vicencio JM,et al.New insights into IGF-1 signaling in the heart[J].Trends Endocrinol Metab,2014,25(3)：128.

[3]鄭百紅,毓明濤,鄭百波,等.微量元素硒對急性病毒性心肌炎患兒脂質過氧化損傷的影響[J].吉林大學學報(醫學版),2004,30(3)：437.

[4]馬沛然,張儀.小兒病毒性心肌炎診治研究進展和展望[J].中國實用兒科雜志,2008,23(10)：790.

[5]孫景輝,翟淑波.病毒性心肌炎發病機制的研究進展[J].臨床兒科雜志,2012,30(7)：607.

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[7]李巖,霍嬌,呂曉華,等.硒多糖對小鼠免疫功能的影響[J].四川大學學報(醫學版),2014,45(3)：512.

收稿日期：(2014-01-16)

文章編號：1007-4287(2015)03-0352-03

通訊作者*

基金項目：長春市科技局項目(2012-150-12SF78)