科瑪嘉顯色培養結合API20C AUX鑒定酵母樣真菌的應用價值

科瑪嘉顯色培養結合API20C AUX鑒定酵母樣真菌的應用價值

趙琳琳，盧念紅，王江元，艾清*

(吉林大學第一醫院二部 檢驗科，吉林 長春130031)

由于人口的老齡化、廣譜抗生素的不規范使用、免疫抑制劑等的應用，侵襲性真菌感染率逐年上升[1，2]。據我國醫院感染監測網分析，醫院真菌感染率從90年代初期的13.9%上升至90年代后期的24.4%[3，4]。侵襲性真菌病多發生在有嚴重基礎疾病的患者，病死率高[3，4]，而抗真菌藥物對深部真菌感染的療效及其預后很大程度取決于早期診治[5，6]，因此真菌感染的早期診斷極為重要。大量臨床資料表明，真菌感染的流行病學特征已經發生改變[3]，這無疑會增加真菌表型鑒定的難度。臨床工作中常用生化反應和科瑪嘉顯色培養鑒定真菌，但常出現鑒定困難的菌株。本研究以分子生物學方法為“金標準”[7]，對科瑪嘉顯色培養結合API20C AUX鑒定酵母樣真菌的結果準確性進行評估。

1材料與方法

1.1　菌株來源

收集本院微生物室2012年1月至2013年12月臨床無菌體液(尿液、腹透液、腦脊液等)和血液標本中分離出的酵母樣真菌121株(剔除同一患者同一部位或不同部位標本反復檢出的相同菌株)，干濾紙片法-80 ℃保存。

1.2　質控菌株

選取5株標準菌株作為質控菌株：白色假絲酵母菌(ATCC90028)、近平滑假絲酵母菌(ATCC22019)、葡萄牙假絲酵母菌(ATCC0611)、光滑球擬假絲酵母菌(ATCC90030)和熱帶假絲酵母菌(ATCC1463)，標準菌株購自衛生部臨床檢驗中心。

1.3　試劑與儀器

PCR擴增試劑盒、低熔點瓊脂糖、DL 2000 DNA Marker、TBE緩沖液、溴化乙錠溶液(上海生工)，LD5-10B低溫離心機(美國賽默飛世爾科技)，T-100PCR儀(美國Bio-rad公司)，FIRE READER XS紫外凝膠成像系統(英國UVITEC公司)，Mini-Sub電泳儀(美國Bio-rad公司)，BC-J80S隔水式恒溫培養箱(上海博訊醫療設備廠)。

1.4　真菌顯色結合API20C鑒定

①真菌顯色培養鑒定：將121株試驗菌株和5株標準菌株接種于沙氏培養基上，36 ℃培養24 h-72 h。重復一次上述操作，使真菌充分復蘇并分離出單個菌落。挑取沙氏培養基上的單個菌落，接種于科瑪嘉顯色培養基上，置36 ℃培養，每24 h觀察1次顯色情況，根據菌落形態和顏色進行判定：綠色、翠綠色為白色假絲酵母菌，藍灰色、鐵灰色為熱帶假絲酵母菌，粉紅色模糊有微毛為克柔假絲酵母菌，紫紅色且菌落濕潤為光滑球擬假絲酵母菌，白色為無法鑒定的其他假絲酵母菌。②API20C鑒定：對顯色培養無法鑒定的其他假絲酵母菌采用API20C方法鑒定，生化譜輸入API20C AUX 3.0系統進行判定：鑒定百分率≥80%且T≥0判定為“可接受的鑒定”，鑒定百分率<80%判定為“無鑒定結果”。

1.5　分子生物學鑒定

①DNA的提取采用煮沸法[8]。②選取真菌通用引物ITS1(5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3)和ITS4(5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3)[9,10]對(部分)18S-ITS1-5.8S-ITS2-(部分)28S rDNA進行PCR擴增。PCR反應體系：PCR Master 25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各2 μl，無菌雙蒸水補齊至50 μl。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s為一個循環(共進行35個循環)，72 ℃延伸8 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工測序，測序結果提交GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，通過基因序列對比分析法將菌株準確鑒定到種。

2結果

2.1　顯色結合API20C與基因序列分析法鑒定結果

121株菌株經顯色培養的鑒定結果有13株無法鑒定，其中108株鑒定結果中有8株鑒定錯誤。13株無法鑒定菌株經API20C的鑒定結果除1株近平滑假絲酵母菌和2株葡萄牙假絲酵母菌鑒定錯誤、1株白色假絲酵母菌無鑒定結果外，其余菌株均鑒定正確。顯色結合API20C鑒定結果的總體正確率為90.08%。(具體結果見表1)

表1　121株真菌基因序列分析與顯色結合API20C鑒定結果

注：( )內為菌株數量，∕為試驗未進行

2.2　顯色培養與顯色結合API20C鑒定結果比較

顯色培養與顯色結合API20C對121株酵母樣真菌的鑒定結果見表2。統計學分析，按α=0.05,χ2=2.84，P>0.05。說明兩種鑒定方法無統計學差異，API20C在臨床中應用后并沒有顯著增加酵母樣真菌的鑒定正確率。

表2　顯色培養與顯色結合API20C鑒定結果(株)

注：1為顯色不典型白色假絲酵母菌，2為ATCC90028白色假絲酵母菌，3為顯色不典型光滑球擬假絲酵母菌，4為ATCC90030光滑球擬假絲酵母菌

圖1同一菌種顯色不典型與顯色典型菌株的顯色結果

3討論

本研究以基因序列分析法鑒定結果為金標準，對顯色培養結合API20C的鑒定能力進行評估，優點有以下幾點：①菌株收集自2012年1月至2013年12月臨床無菌體液和血液標本中分離出的全部酵母樣真菌，在菌種構成上與臨床符合。而從菌種庫中選取的菌株少見菌種的比例常較臨床分離菌株高，這與臨床實際情況不符。②本研究還原了臨床工作中酵母樣真菌的鑒定程序：先用顯色培養鑒定，僅對顯白色和顯色不典型菌株用API20C 鑒定。這樣得出的結果更能反應顯色結合API20C在臨床中的應用價值。

科瑪嘉顯色培養鑒定的結果中，8株菌株顯色結果與分子生物學方法鑒定結果不一致，2株常見菌株無法鑒定，可能原因有：①觀察時間不足。熱帶假絲酵母菌觀察時間較其他菌種長，常需要72 h或更長時間才能正確鑒定，若時間不足，易錯誤鑒定為光滑球擬假絲酵母菌。②菌株顯色不典型。如本研究中出現的顯白色的白色假絲酵母菌(圖1.1)，顯橘紅色的光滑球擬假絲酵母菌(圖1.2)。

本研究顯色結合API20C鑒定酵母樣真菌的正確率為90.08%，說明臨床工作中能夠將大多數臨床分離菌株準確鑒定到種。顯色培養鑒定結果與顯色結合API20C鑒定結果的差異無統計學意義，說明臨床工作應用API20C后，酵母樣真菌的鑒定正確率并未出現顯著提高。大多數臨床微生物室對顯色培養可以鑒定的菌株不再進行API20C的鑒定，API20C僅用于顯色無法鑒定的菌株。本研究中，經API20C鑒定的13株中，3株鑒定錯誤，1株無鑒定結果，鑒定正確率僅為69.23%(9/13)，API20C在臨床中的應用效果并不理想。

傳統的真菌鑒定方法對真菌的鑒定能力有限，而分子生物學的發展使真菌感染的早期診斷成為可能，通過基因序列對比可快速準確將真菌鑒定至種，進而達到指導臨床對侵襲性真菌病進行早期診斷和早期用藥的目的，但其尚未得到廣泛應用。所以，利用PCR技術對真菌進行早期準確的診斷仍是我們今后的研究重點。

參考文獻：

[1]耿佳靖,袁梁,魯辛辛.18S rRNA基因序列分析在臨床常見酵母樣真菌鑒定中的應用[J].中華檢驗醫學雜志,2009,32 (6):644.

[2]Bishop JA,Chase N,Magill SS,et al.Ccandida bracarensis detected among isolates of candida glabrata by peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization susceptibility data and documentation of presumed infection[J].J Clin Microbiol,2008,46:443.

[3]章強強.我國深部真菌感染及其檢測的現狀分析[J].實用皮膚病學雜志,2011,4 (3):129.

[4]鐘南山,葉楓.深部真菌感染:新的挑戰與展望[J].中華結核和呼吸雜志,2006,29 (5):289.

[5]Suporn Foongladda,Nanthanida Mongkol,Pornphan Petlum.Multi-probe Real-Time PCR Identification of Four Common Candida Species in Blood Culture Broth[J].Mycopathologia,2014,177:251.

[6]Erjavec Z,Kluin-Nelemans H,Verweij PE.Trends in invasive fungal infections,with emphasis on invasive aspergillosis[J].J Clin Microbial Infect,2009,15 (7):625.

[7]范欣,王賀,吳玥,等.以分子生物學鑒定結果為“金標準”評估Rapid ID Yeast Plus及API20C AUX對酵母樣真菌的鑒定效能[J].中國真菌學雜志,2013,8 (5):274.

[8]李詠梅,李惠.改良煮沸法對白念珠菌的聚合酶鏈反應檢測的影響[C].第四屆中國西部地區皮膚性病學術研討會論文集.2006:197-199.

[9]Kumar M,Shukla PK.Use of PCR targeting of internal transcribed spacer regions and single-stranded conformation polymorphism analysis of sequence variation in different regions of rRNA genes in fungi for rapid diagnosis of mycotic keratitis[J].J Clin Microbiol,2005,43:662.

[10]陳鳳毛.真菌ITS區序列結構及其應用[J].林業科技開發,2007,21 (2):5.

收稿日期：(2014-01-30)

作者簡介：艾清，副教授，副主任醫師，碩士生導師。

文章編號：1007-4287(2015)01-0022-03

通訊作者*