shRNA干擾MDR1基因逆轉胃癌細胞多藥耐藥性的研究

王曉鑫，王朝陽，周　靜

(1內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050；2內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059)

shRNA干擾MDR1基因逆轉胃癌細胞多藥耐藥性的研究

王曉鑫1，王朝陽1，周靜2*

(1內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050；2內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0543)

腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是引起腫瘤化療失敗的重要原因之一。由MDRl基因編碼的P-糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp) 作為一種ATP依賴性藥物泵,影響藥物在細胞內聚集,是導致MDR最直接原因。P-gp在胃癌細胞中呈高表達，且與細胞耐藥性的產生密切相關[1]。因此MDR1/P-gp可作為逆轉胃癌多藥耐藥的靶點。本實驗通過短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA) 技術沉默MDR1基因，轉染胃癌耐奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)細胞SGC7901/L-OHP，觀察轉染前后胃癌細胞對化療藥L-OHP和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)敏感性的變化，為臨床胃癌化療耐藥性的逆轉、提高療效，尋找新的靶點和途徑提供實驗依據。

1材料與方法

1.1主要材料SGC7901細胞購自中山大學實驗動物中心細胞庫；質粒pGPU6/GFP/Neo、大腸桿菌DH5α、特異針對MDR1基因及非特異性陰性對照序列購自上海吉瑪公司；Lipofectimane2000脂質體轉染試劑盒、Trizol購自Invitrogen公司；質粒小量抽提試劑盒購自Qiagen公司；P-gp一抗和羊抗兔二抗購于Santa公司， RNA反轉錄試劑盒、SYBR GreenI熒光定量試劑盒購于 Gene Copoeia公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、H-DMEM和胎牛血清購自Gibco公司；L-OHP、5-FU 購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.2細胞培養用含10 %胎牛血清的H-DMEM培養基培養SGC7901細胞，在37℃、5 %CO2條件下孵育，2～3 d 換液一次，常規消化傳代。

1.3構建SGC7901/L-OHP耐藥細胞系篩選IC90濃度L-OHP下存活的SGC7901細胞克隆，采用劑量遞增法誘導產生耐藥細胞[2]。在細胞傳代換液時加入不同濃度的L-OHP，首次加藥劑量為1.6 μg·mL-1(1/9IC50)，每周傳代2 次。待細胞生長良好進入對數生長期增加0.5倍L-OHP藥物濃度，最高濃度為18.2 μg·mL-1。給藥4月后獲得對L-OHP耐藥的SGC7901細胞，命名為SGC7901/L-OHP細胞。實驗檢測前1w停用L-OHP處理。

1.4MTT法檢測L-OHP、5-FU對SGC7901/L-OHP的細胞毒作用 收集對數生長期的SGC7901和SGC7901/L-OHP細胞， 制成細胞懸液，按1×104個·孔-1細胞接種于96 孔細胞培養板中，培養24 h后，分別加入不同濃度的L-OHP (64、32、16、8、4、2μg·mL-1)，5-FU(160、80、40、20、10 和5 μg·mL-1)，繼續培養24 h。每孔加入MTT 20 μL，混勻，再培養4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分震蕩后酶標儀上測570 nm 波長處吸光度值。每一濃度設5 個平行孔，重復3 次實驗。以背景組調零，按以下公式計算各組細胞的存活率：細胞存活率=(OD570實驗組-OD570背景組)/(OD570空白組-OD570背景組)×100% ；并計算各組IC50值和耐藥倍數(resistance fold，RF)：RF =IC50(耐藥細胞)/ IC50(親本細胞)。

1.5細胞轉染轉染前16 h，將SGC7901/L-OHP耐藥細胞以1×106·孔-1的密度接種于6 孔培養板，按照Lipofectamine TM2000 試劑盒說明書操作，將脂質體和質粒孵育形成脂質復合體，轉移到細胞培養板中，6 h 后更換含10 %胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。實驗分為3組：空白對照組、陰性質粒組、重組質粒組(pGPU6/GFP/Neo- MDR1組)。

1.6real-time PCR 檢測MDR1 mRNA 的表達將質粒轉染SGC7901/L-OHP細胞36 h后，用Trizol 試劑提取總RNA。測定各組細胞的總RNA濃度，然后反轉錄為cDNA。按照試劑盒的方法，進行real-time PCR 反應。β-actin 為內參，上游引物:5′-GCACCTGTAGCGCAAAGAGC-3′，下游引物:5′-GTTCATTCCCTGTAACGCCT-3′， 62 ℃退火。MDR-1 基因上游引物:5′-GATTATTCTTAAAGATCAAT-3′，下游引物:5′-TTAGAAACTTAATATTATTC-3′，58 ℃ 退火。實驗重復3 次。

1.7Western blot 檢測P-gp的表達免疫共沉淀裂解液提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳。每孔加入50 pg蛋白質，將電泳分離的蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜上，封閉過夜，加入P-gp一抗孵育2 h，PBST洗滌3 次，羊抗兔二抗孵育2 h，洗滌3 次。用Labwork4圖像分析軟件進行光密度積分值分析。

1.8體外藥物敏感性實驗實驗分為3組：空白對照組、陰性質粒組、重組質粒組(pGPU6/GFP/Neo MDR1組)。將SGC7901/L-OHP細胞接種于96 孔板( 每孔1×104個細胞) ，按1.4 MTT法檢測L-OHP、5-FU對pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質粒轉染的SGC7901/L-OHP細胞的細胞毒作用，并計算IC50值。每一濃度設5 個平行孔，重復3 次實驗。

2結果

2.1SGC7901/L-OHP耐藥細胞系的建立采用藥物濃度遞增法獲得了能耐受18.2μg·ml-1L-OHP生長良好的SGC7901/L-OHP耐藥細胞。MTT法檢測結果顯示：L-OHP作用SGC7901細胞的IC50值(12.26μg·ml-1)明顯低于作用SGC7901/L-OHP細胞的IC50值(74.33μg·ml-1)，差異有統計學意義(P< 0.01)，RF為6.06。本實驗誘導獲得的SGC7901/L-OHP細胞不僅對L-OHP耐藥， 而且對5-FU也產生交叉耐藥特性，RF為1.82(表1)。

2.2pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質粒轉染SGC7901/L-OHP細胞轉染24h后，空白對照組無熒光表達，陰性質粒組和pGPU6/GFP/Neo-MDR1重組質粒組均可見綠色熒光表達，轉染率達90%以上(圖1)。

表1　　SGC7901和SGC7901/L-OHP細胞對L-OHP和5-FU

*P<0.05，**P<0.01，vs SGC7901 group

2.3real- time PCR法檢測MDR-1基因表達以β-actin為內參，與空白對照組和陰性質粒組比較，重組質粒組細胞內MDR1 mRNA表達水平顯著下調[(23.019±0.084)%]，與空白對照組[(89.649±0.052)%]和陰性質粒組[(85.701±0.075)%]比較，差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明pG-PU6/GFP/Neo- MDR1重組質粒轉染SGC7901/L-OHP細胞后MDR1基因被穩定抑制，成功沉默SGC7901/L-OHP細胞株的MDR1基因。

A:negative plasmid group; B:recombinant plasmid group(×100)

2.4Western blot檢測P-gp蛋白的表達重組質粒組P-gp蛋白表達受抑制(0.366±0.025)，明顯低于空白對照組(0.679±0.027)和陰性質粒組(0.692±0.024)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A:control group; B:recombinant plasmid group;C:negative

plasmid group

圖2P-gp蛋白表達

2.5沉默MDR1后的SGC7901/L-OHP藥物敏感性實驗pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質粒轉染SGC7901/L-OHP細胞后，用MTT法檢測L-OHP、5-FU對SGC7901/L-OHP的IC50。結果顯示，沉默MDR1基因后，耐藥細胞SGC7901/L-OHP與陰性質粒組和空白對照組相比不僅對L-OHP的IC50明顯下降，而且對5-FU的IC50也降低，差異有顯著性(P<0.05)。說明沉默MDR1可以改善胃癌細胞的多藥耐藥性，增加細胞對L-OHP和5-FU的敏感性(表2)。

表2　shRNA干擾MDR1基因表達后 SGC7901/L-OHP

*P<0.05，vs control group

3討論

目前，化療是胃癌的最主要治療措施，但腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥現象尤其是多藥耐藥，往往導致化療失敗。腫瘤多藥耐藥是指對某一種藥物產生耐藥性的同時，腫瘤細胞對結構不同、細胞作用靶點不同的多種化療藥物產生交叉性耐藥[3]。MDR的產生嚴重影響了腫瘤的化療效果[4]。MDR1 基因編碼P-gp蛋白的過表達，在臨床化療耐藥中發揮顯著作用，尤其是實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤，包括消化道腫瘤：結腸癌、胃癌等。P-gp 蛋白是一種ATP 依賴性藥物跨膜外流泵，與化療藥結合后能依賴ATP 供能將疏水性藥物泵出細胞外，使細胞內藥物有效濃度下降，造成耐藥現象[5,6]。因此逆轉P-gp介導的多藥耐藥策略成為克服腫瘤多藥耐藥的最直接的方法[7,8]。目前已開發了以P-gp為靶點的三代抑制劑(維拉帕米，環孢素A類似物，多非喹達，米托坦等)抑制P-gp的表達或者功能，但是它的II /III 期臨床試驗并沒有取得滿意的效果，限制了其廣泛的應用[9]。RNA干擾技術是近年來發展起來的一項新的基因沉默技術，用與靶基因序列同源的雙鏈RNA誘導，沉默細胞內同源mRNA的表達，而不影響其他基因的mRNA表達，達到特異性剔除或關閉特定基因表達的效果，表現為轉錄后的基因沉默[10]。RNA干擾技術已被廣泛用于探討基因功能和惡性腫瘤的基因治療領域。其中shRNA技術與傳統RNA干擾技術相比具有特異性強、容易轉染、表達豐度高的特點[11]。因此本實驗通過shRNA技術干擾胃癌耐藥細胞株SGC7901/L-OHP中MDR1基因的表達，觀察轉染后耐藥細胞株對L-OHP和5-FU耐藥性的逆轉作用。

L-OHP是鉑類化療藥的一種，通過與DNA鏈的堿基形成交叉聯結而破壞DNA的結構和功能。L-OHP是臨床治療胃癌的一線化療藥和術后輔助化療藥。但L-OHP在臨床廣泛應用的同時，也產生了腫瘤耐藥的嚴重問題，導致化療的失敗。本研究以L-OHP為誘導劑，采用逐漸增加L-OHP濃度誘導建立人胃癌細胞SGC7901/L-OHPL-OHP耐藥模型。MTT結果顯示L-OHP 對SGC7901/L-OHP細胞作用的IC50值比SGC7901細胞明顯升高，RF為6.06，而且對5-FU也表現一定的耐藥性。5-FU常與L-OHP聯合組成DF方案用于胃癌的常規化療。按照RF<5認為是低度耐藥，RF為5～15中度耐藥，RF>15高度耐藥[12]。SGC7901/ L-OHP細胞對L-OHP屬于中度耐藥，對5-FU具有低度耐藥，證實SGC7901/ L-OHP具有多藥耐藥細胞系的特征。

pGPU6/GFP/Neo- MDR1重組質粒穩定轉染SGC7901/ L-OHP后，經real-time PCR 和Western blot 檢測，SGC7901/L-OHP細胞中MDR1 基因的表達顯著降低(P<0.01) ，MDR1基因的表達產物P-gp的表達下降(P<0.05)。說明shRNA技術能高效、特異性地阻斷特定基因的表達，使目標基因MDR1的同源mRNA降解，減少特異蛋白P-gp的表達，最終實現功能的抑制。細胞藥敏試驗表明干擾MDR1基因可有效逆轉SGC7901/ L-OHP細胞耐藥性，使胃癌細胞對L-OHP和5-FU敏感性提高。以上結果均提示shRNA技術沉默MDR1基因可有效逆轉胃癌細胞的多藥耐藥，MDR1基因是逆轉腫瘤耐藥的有效靶點。

參考文獻：

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摘要：目的利用短發夾RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技術沉默多藥耐藥基因1(multidrug resistance,MDR1)，探討其對SGC7901/ L-OHP細胞株多藥耐藥性的逆轉作用。方法采用逐步增加藥物濃度法建立耐奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)的胃癌細胞株SGC7901/L-OHP，用shRNA技術沉默MDR1基因在SGC7901/ L-OHP細胞中的表達，以real-time PCR 檢測細胞中MDR1 mRNA 的表達，Western blot 檢測細胞中P糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp)的表達，MTT法檢測轉染后SGC7901/L-OHP細胞對L-OHP和5-FU的敏感性。結果shRNA沉默SGC7901/ L-OHP細胞株MDR1基因后，與空白組和陰性質粒組比較，MDR1 mRNA表達抑制(P<0.01)，且P-gp表達下調(P<0.05)。干擾后的SGC7901/L-OHP細胞對L-OHP和5-FU的敏感性顯著升高(P<0.05)。結論shRNA可有效沉默SGC7901/ L-OHP胃癌耐藥細胞株MDR1基因的表達，提高耐藥的胃癌細胞對化療藥的敏感性。

關鍵詞：胃癌；多藥耐藥；shRNA

Reversion of multidrug resistance in gastric cancer cell by shRNA targeting MDR1 geneWANGXiao-xin1,WANGZhao-yang1,ZHOUJing2.(1.AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010050，China;2.InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China)

Abstract:ObjectiveTo silence the expression of multidrug resistance (MDR1) gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using short hairpin RNA (shRNA) in order to reverse its resistance to MDR1.MethodsA human drug-resistance gastric cancer cell line,SGC7901/L-OHP,was generated by continuous exposure to gradually increasing concentrations of L-OHP. MDR1 gene expression in SGC7901/ L-OHP cells was inhibited by using shRNA. The expression of MDR1 mRNA in SGC7901/ L-OHP cells was assayed by real-time PCR. The P-gp protein expression was determined by Western blot analysis. The sensitivity to L-OHP and 5-FU was measured by MTT assay in SGC7901/ L-OHP cells after shRNA. ResultsCompared with the control group and negative plasmid group,the expression of MDR1 mRNA and P- gp were reduced obviously after silencing the expression of MDR1 gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using shRNA (P<0.01,P<0.05). The sensitivity of SGC7901/L-OHP cells to L-OHP and 5-FU increased significantly after the interference (P<0.05). Conclusion shRNA can effectively inhibit the expression of MDR1 gene in SGC7901/L-OHP cell line and improve the sensitivity of gastric cancer cells to chemotherapy drugs.

Key words:Gastric cancer; Multidrug resistance; short hairpin RNA

收稿日期：(2014-02-21)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R735.2

通訊作者*

基金項目：內蒙古醫科大學博士啟動基金(BSJJ2013,BSJJ2012)；內蒙古自治區高等學校科學研究項目(NJZY14132)