胃癌患者細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5蛋白的檢測意義

胃癌患者細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5蛋白的檢測意義

曾靜, 張俊

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院 體檢中心, 湖北 十堰, 442000)

關鍵詞:胃癌; 細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5; 檢測

胃癌是消化道的一種常見惡性腫瘤，對人類的健康構成了嚴重的威脅[1]。1992年細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 5(Cdk5)被鑒定，定位于染色體7號長臂第3區第6帶(7q36)上，其能在全身不同組織細胞內分布[2]。本研究通過免疫組化染色等方法探討胃癌中Cdk5蛋白的表達及意義，現報告如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

分析2010年5月—2014年5月在本院接受手術治療的胃癌患者的胃癌組織和癌旁正常組織標本(包埋于石蠟中)。病例需全部接受病理的確診。術前病例均無任何放化療史，對所有患者實施D2胃癌根治術。隨訪全組患者，隨訪時間為3～76個月。由經驗豐富的2位病理醫師復查所有入選對象的HE切片，確保病理診斷的準確性。

1.2　研究方法

免疫染色二步法: ① 將包埋于石蠟中胃癌組織切片(4 μm)后烘干; ② 使用梯度松節油和酒精對切片進行脫蠟，然后用蒸餾水和PBS液水化切片; ③ 對切片實施高壓法達到將抗原修復的目的; ④ 孵育后PBS液沖洗; ⑤ 滴加一抗，即兔抗人Cdk5多克隆1∶500); ⑥ 滴加試劑MT-CelLytics，滴加試劑RIPA(細胞裂解液); ⑦ 使用DAB溶液進行顯色反應; ⑧ 采用蘇木素對切片進行復染; ⑨ 將切片脫水后使用中性樹膠進行封片處理; ⑩ 構建空白對照，用PBS液代替步驟⑤中的一抗，其他均相同。

一抗用PBS代替作陰性對照，組織呈陽性作陽性對照。隨機從每片中抽取高倍視野(×400) 5個，計算細胞陽性率。判斷染色結果：參照腫瘤著色強度和細胞陽性率記分。著色強度：≥4分，高表達; 1～3分，低表達; 0分，無表達。細胞陽性率: >51%, 3分; 26%～50%，2分; 6%～25%，1分；≤5%，0分。

提取胃癌組織蛋白: ① 在勻漿器內將胃癌組織與MT-CelLytics、Mammalian Protease Inhibitor Cocktail勻漿; ② 離心勻漿液; ③ 提取上清液存于冰箱內備用。

蛋白定量(BAC法): ① 配制蛋白標準液; ② 配制BAC工作液; ③ 在96孔板中加適量標準品于標準品孔內，樣品孔內加入體積樣品; ④ 將BAC工作液加入各孔內; ⑤ 通過測量波長、A562以及標準曲線計算蛋白濃度。

免疫印跡法(檢測Cdk5蛋白在新鮮胃癌組織中的表達量): ① 變性蛋白樣品與緩沖液的混合液后制膠; ② 在泳道內滴加預染蛋白marker及樣品; ③ 電泳后電轉膜; ④ 使用硝酸纖維素膜進行染色反應; ⑤ 將免疫反應非特異性的結合位點封閉后加一抗，孵育; ⑥ 回收一抗后滴加二抗; ⑦ 取ECL發光試劑適量進行發光反應; ⑧ 掃描、曝光; ⑨ 和密度半定量分析。比較胃癌組織與癌旁組織、原發灶與轉移灶的Cdk5表達差異，并探討Cdk5表達與胃癌組織的病理特征間的相關性。

1.3　統計學方法

數據均采用SPSS 19.0軟件進行分析。數據計量以均數±標準差表示，比較采用卡方(χ2)檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1　一般資料

本研究共納入胃癌患者103例，包括胃癌組織及癌旁組織標本各103個。入組的患者臨床資料見表1。

表1　患者臨床資料

2.2　胃癌與癌旁組織、原發灶與轉移灶的Cdk5表達比較

胃癌與癌旁組織、原發灶與淋巴結轉移灶的Cdk5陽性表達強弱見表2, 可見胃癌組織的Cdk5強陽性表達率顯著低于癌旁組織(χ2=18.26,P<0.01)。

表2　胃癌與癌旁組織、原發灶與轉移灶的Cdk5表達比較

2.3　Cdk5表達與胃癌組織的病理特征相關性

不同病理特征包括組織學分型、腫瘤直徑、腫瘤部位、Borrmann分型及淋巴結轉移情況的胃癌組織所對應的Cdk5表達情況見表3，結果提示胃癌組織的Cdk5的陽性表達與胃癌組織的組織學分型(χ2=11.59,P<0.01)、Borrmann分型(χ2=10.53,P<0.01)和淋巴結轉移情況(χ2=14.62,P<0.01)均有顯著相關性。

表3　Cdk5表達與胃癌組織的病理特征相關性

3討論

目前中國胃癌的死亡率在逐年上升，對中國人的健康構成了嚴重的威脅，給家庭和社會都造成了沉重的負擔，是常見的一種惡性腫瘤[3]。Cdk5是周期依賴性蛋白酶一族中的特殊成員，其不直接對細胞周期(哺乳動物)進行調控，細胞周期蛋白也不能將Cdk5激活[4]。Cdk5可以在大腦發育期間調控神經細胞的死亡和生存信號、遷移、軸突和分化的延伸、激活和形成突觸以及骨架成分等，參與多種疾病的發病過程，跟各種腫瘤的形成都有著密切的關系[5]。

本研究實施免疫組化染色SP法，結果顯示在胃癌組織內，Cdk5表達的弱陽性、強陽性率與癌旁組織相比較，二者的差異有統計學意義。將患者病理學參數和Cdk5的表達程度結合分析發現，Cdk5的表達程度和胃癌的Borrmann分型、淋巴結是否發生轉移以及組織學分型的關系都很密切，因此作者可以推測Cdk5蛋白與胃癌的發生可能有關聯，呈現出的低表達率也許對胃癌的發病過程起著一定的促進作用[6]。此外，本研究還發現Cdk5 蛋白在淋巴結轉移癌組織內的陽性率比原發胃癌組織中明顯低，差異有統計學意義[7]。將患者病理學參數和Cdk5的表達程度結合分析發現，Cdk5的表達程度和淋巴結轉移量以

及腫瘤浸潤深度密切相關，腫瘤浸潤深度隨著Cdk5表達的降低而加深，淋巴結轉移量隨著Cdk5表達的降低而增加，故作者推測Cdk5對抑制蛋白的轉移起著一定的作用，胃癌病程中，癌細胞使自身Cdk5蛋白的水平下降，從而達到促進浸潤轉移的目的[8]。

還有研究[9]指出Cdk5表達是對胃癌患者預后評估的一個獨立因素，患者的5年存活率是隨著Cdk5在癌組織內表達的上升而上升。在胃癌的診療方面，Cdk5蛋白有望成為靶點。總之，本研究結果顯示，相對癌旁組織，Cdk5在胃癌組織內為明顯低表達；而相對原發的胃癌組織，Cdk5在淋巴結轉移癌中為明顯低表達；同時發現Cdk5的表達與腫瘤的組織學分型、淋巴結是否發生轉移及Borrmann分型密切相關[10]。

參考文獻

[1]Ma Y, Zhang L, Rong S, et al. Relation between gastric cancer and protein oxidation, DNA damage, and lipid peroxidation[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013: 543760.

[2]Wu X L, Cheng B, Li P Y, et al. MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(43): 7758.

[3]Zhang J, Zhan Z, Wu J, et al. Relationship between EGF, TGFA, and EGFR Gene Polymorphisms and Traditional Chinese Medicine ZHENG in Gastric Cancer[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013: 731071.

[4]顏偉, 張永紅, 何樂亞, 等. 胃癌中CDK1和CDK2的表達及預后意義[J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2010, (02): 165.

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[6]Zhang B, Hao GY, Gao F, et al. Lack of association of common polymorphisms in MUC1 gene with H. pylori infection and non-cardia gastric cancer risk in a Chinese population[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7355.

[7]Tuncel T, Karagoz B, Haholu A, et al. Immunoregulatory function of HLA-G in gastric cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7681.

[8]謝妮. 環氧化酶2、細胞周期調節蛋白依耐性激酶CDK2在胃癌中的表達[J]. 南華大學學報:醫學版, 2009, (06): 703.

[9]Yang L, Sun M J, Liu J W, et al. IL-6-6331 (T/C, rs10499563) is associated with decreased risk of gastric cancer in Northern Chinese[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7467.

[10]王妍, 周建獎, 謝淵, 等. 鈣調蛋白、鈣網蛋白及周期蛋白依賴性激酶1基因在胃癌組織中的表達[J]. 腫瘤防治研究, 2013, (2): 151.

基金項目:湖北省十堰市科技局科研項目(EK2013D150001000079)

收稿日期:2014-12-20

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-153-02

DOI:10.7619/jcmp.201509051