中心組合設計及響應曲面法優化炒梔子中試工藝*

中心組合設計及響應曲面法優化炒梔子中試工藝*

★馬志林*第一作者: 馬志林(1982—)，男，碩士。研究方向：中藥分析。梅玲華*通信作者: 梅玲華(1962—)，女，執業中藥師。Tel：021-50272965，E-mail：jackey5460@163.com。沈麗琴杜育華胡浩武(江西匯仁藥業有限公司南昌 330004)

摘要：目的：優化炒梔子的中試工藝，考察炒梔子中試炮制工藝過程中梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量變化。方法：分別對炮制工藝參數炒制時間、炒制溫度、藥機轉速、投料量因素進行單因素考察，以梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量為評價指標，采用中心組合設計及響應曲面法結果分析進行評價，通過數據模擬及驗證方法對梔子飲片中試工藝進行工藝確認。結果：根據分析得到最優中試炮制工藝條件為：炒制溫度為184.6℃，炒制時間15 min，藥機轉速20r/min，該藥機單次最佳投料20kg；梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II含量的預測值分別為40.36，6.26、0.80mg/g，本研究預測值通過中試放大生產得到了良好的驗證，且在炮制品色澤方面均符合藥典規定要求。結論：本研究優化結果為梔子飲片炮制中試工藝提供指導性實驗依據。

關鍵詞：中心組合設計；響應曲面法；炒梔子；炮制工藝；梔子苷

梔子性苦、寒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效[1]。為適應中醫臨床辨證的需求，梔子常以其炮制品入藥，其炮制方法有多種，現代主要沿用生品、炒黃、炒焦、炒炭、姜汁炙等。《中國藥典》2010年版一部中收載的梔子加工方法有生梔子、炒梔子、焦梔子，其中炒梔子在臨床應用中最為廣泛，2010年版《中國藥典》僅規定了其炒制的色澤及梔子苷含量，其中試炮制工藝參數無明確規定。本實驗主要對在中試工藝過程中炮制參數，如炒制時間、炒制溫度、藥機轉速、投料量因素進行單因素主次影響比較，以梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量分別為評價指標，采用中心組合設計及響應曲面法對炒梔子炮制工藝進行優化，并考察炮制過程中炒制過程中隨著各因素的變化分別對梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量影響。

1材料

Agilent 1100系列高效液相色譜儀(安捷倫科技公司)，色譜柱YMC-Pack ODS-AQ(150mm×6.0mm,5μm，YMC公司)，CP225 D型1/10萬電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，YF-113型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市環球藥械廠)，CY800-III型滾筒式炒藥機(常熟倍誠中藥機械廠)，ST-20 Raytek Raynger型紅外測溫槍(美國雷泰公司)。

梔子采自樟樹梔子種植基地，經江西中醫學院羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子Gardeniaja.sminnde.sEllis的干燥成熟果實。梔子苷(中國食品藥品檢定研究院，批號110749-200714)、西紅花苷-I、西紅花苷-II對照品(均購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為MUST-11071108、MUST-11091002)，甲醇、乙睛為色譜純，水為雙蒸水(自制)，其他試劑均為分析純。

2方法和結果

2.1梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量測定

2.1.1色譜條件色譜柱YMC-Pack ODS-AQ(150mm×6.0mm,5μm,YMC公司)，流動相：甲醇(A)-水溶液(B)，梯度洗脫(0→15 min，A為20%；15→20 min，A 為20%→48%；20→50 min，A 為48%)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：0～24min為238nm，24～45min為440nm；進樣量：l0μL。按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各l0μL，注入液相色譜儀。結果表明，梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的譜峰分離良好。色譜見圖1

A 混合對照品；B供試品；1-梔子苷，

2.1.2對照品制備分別精密稱取梔子苷對照品與西紅花苷-I、西紅花苷-II標準品適量，加甲醇制成每1mL梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II分別約含220.0, 13.0，3.0μg的混合溶液，即得。

2.1.3供試品制備取梔子藥材粉末(過4號篩)約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻濾過。精密量取續濾液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4線性關系考察精密吸取混合對照品溶液2，5，10，15，20，25μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II色譜峰峰面積積分值，以峰面積積分值(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標，進行線性回歸，得3種成分的回歸方程、相關系數與線性范圍，見表1。

2.1.5穩定性試驗取“2.1.3”項下供試品溶液，按上述色譜條件分別于0,2,4,6,8,12,24 h注入液相色譜儀，進樣10μL。結果，梔子苷的峰面積RSD=0.49%(n=6)；西紅花苷-I的峰面積RSD=0.76% (n=6)，西紅花苷-II的峰面積RSD=0.92 % (n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

表1　線性回歸方程、相關系數及線性范圍

2.1.6精密度試驗精密吸取“2.1.3”項下供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行分析，連續重復進樣6次。結果梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II的RSD分別為1.32 %，1.52 %，1.50 %(n=6)，表明本方法精密度較好。

2.1.7重復性試驗取同一批樣品，照“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按上述擬定的含量測定方法操作。結果，梔子苷的平均含量為45.66mg/g， RSD=1.61% (n=6);西紅花苷-I的平均含量為7.792 mg/g，RSD=1.68%(n=6);西紅花苷-II的平均含量為1.684mg/g ，RSD=1.23 % (n=6)，表明本方法重復性較好。

表2　加樣回收率試驗結果(n=6)

2.1.8加樣回收率試驗取已知含量樣品(梔子苷 46.71mg/g，西紅花苷-I 7.20mg/g，西紅花苷-II 1.80mg/g)的樣品共6份，精密稱取0.1g，置具塞三角瓶中，分別精密加入梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II混合對照品甲醇溶液(梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II濃度分別為191.2μg/mL，26.78μg/mL，6.82μg/mL ，25mL，按供試品制備方法項下方法制備供試品溶液。吸取加樣供試品溶液10μl注人液相色譜儀，按上述色譜條件測定梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II的含量，計算加樣回收率，結果見表2。

2.2梔子炮制

2.2.1因素水平設計根據前期單因素實驗研究可知，不同因素對梔子有效成分的含量影響程度不同，為了進一步優化炮制條件，本研究選擇中心組合實驗設計，分別對以上4個影響因素進行設計，選取的水平如表3所示。

表3　影響梔子中試炮制因素與水平

表4　中心組設計實驗結果

各因素的組合即實驗結果見表4所示，在實驗設計中，每個實驗點重復3次，結果取平均值，以炒制溫度A、炒制時間B、炒藥機轉速C、中試投料量D，以梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II等指標作為響應值，利用Design-expert8.0.5軟件對表中的實驗結果進行回歸分析，得到梔子苷二元多次方程模型。

以梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II含量為響應值，用Design Expert8.0.5統計軟件中ANOVA項進行分析，表5顯示梔子苷模型的P=0.001 1(P<0.05)，相關系數R2=0.817，表明該模型顯著，精確度基本滿足要求。而西紅花苷-I和西紅花苷-II模型的P值均大于0.05，模型不顯著，結果分別見表6-7。在各項方差分析中，當P值小于0.05時表明影響顯著，因此，在梔子苷含量中，A、B、C的一次項、B2對梔子苷含量影響顯著，回歸方程為：

Y1=33.12+3.18*A-2.57*B-3.41*C+1.76*A*B+1.57*A*C+0.91*B*C-2.42*A2+6.76*B2-0.61*C2

西紅花苷-I含量中，AB、A2、B2對西紅花苷-I含量影響顯著，回歸方程為：

Y2=4.52+0.18*A+0.022*B-0.23*C+0.61*A*B-0.34*A*C+0.10*B*C-0.91*A2+1.00*B2+0.23*C2

西紅花苷-II含量中，各因素對其含量影響均不顯著，回歸方程為：

Y3=0.63-9.986E-003*A-0.058*B-0.035*C+0.065*A*B-0.058*A*C+1.240E-003*B* C-0.061*A2+0.051*B2+0.091*C2

A項的負系數表明它的改變帶來響應值的降低，B、C項的正系數能夠引起響應值的增高，二次項的負系數決定方程拋物面的開放，這說明它有一個極大值，故能實現優化分析。通過觀察線性項和二次項系數，可以得出各因素對梔子苷含量的影響次序為：中試溫度>中試炒制時間>中試轉速>中試投料量。

2.2.2響應面法優選工藝條件 炒制溫度和炒制時間、炒制溫度和藥機轉速、炒制時間和藥機轉速對梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II含量的二階回歸模型的效應面圖見圖2-4。通過圖中各因素對響應值的直觀分析，可以對兩因素間的相互作用分別進行分析。

圖2　炒制溫度和炒制時間對梔子苷、

由圖2可知，炒制溫度較低時，梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量分別隨著溫度的增加而增加，當溫度超過一定值時，梔子苷含量反而隨其增加而減小。梔子苷的含量隨著炒制時間的增加而減少，當時間超過一定值時，它們的含量又隨其增加而增加。由圖可以看出，兩因素的交互作用顯著。

由圖3可知，炒制溫度較低時，梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量隨著溫度的增加而增加，當溫度超過一定值時，梔子苷含量趨于平穩，而西紅花苷-I、西紅花苷-II的含量卻隨著溫度的升高而降低。藥機轉速對梔子苷、西紅花苷-I的含量的影響不大；而西紅花苷-II的含量卻隨著藥機轉速增加而降低，當藥機轉速超過一定值時，其含量又隨其升高。由圖可以看出，兩因素的交互作用顯著。

圖3　炒制溫度和藥機轉速對梔子苷、

圖4　炒制時間和藥機轉速對梔子苷、

由圖4可知，炒制時間較短時，梔子苷、西紅花苷-I的含量隨著炒制時間的增加而降低，當炒制時間超過一定值時，梔子苷、西紅花苷-I含量又隨其增加而升高；而西紅花苷-II的含量總體上是隨著炒制時間的增加而升高。而藥機轉速對梔子苷、西紅花苷-I的含量影響不大；反而對西紅花苷-II的影響顯著，總體上隨著藥機轉速的增加西紅花苷-II的含量增加。由圖可以看出，兩因素的交互作用不顯著。

2.2.3梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II含量方差分析結果見表5-7。

2.2.4最優條件的確定根據上述實測結果以及方差分析結果表明：梔子飲片中試工藝的最佳條件為：炒制溫度為184.6℃，炒制時間15min，藥機轉速20r/min，投料20kg。結合軟件模擬預測得到了梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II含量預測值分別為40.36，6.26，0.80mg/g，表明實驗方法相對可靠。因此，我們認為采用Box-Behnken的中心組合試驗設計優化得到的梔子中試工藝條件準確可靠，具有實際指導意義。

2.2.5中試工藝放大驗證為了對上述預測值進行合理性驗證，我們基于上述建立的數學模型，確定得到最優條件：炒制溫度為184.6℃，炒制時間15min，藥機轉速20r/min，投料20kg。然后，我們進行了進一步中試生產驗證，放大生產的3批梔子飲片，以檢驗其炒制飲片工藝的可靠性，根據炒制參數要求，分別生產制備了1，5，8，10倍量的梔子飲片，即制備量分別為20，100，160，200kg的梔子炒制品。分別對這4批次梔子飲片進行了主要有效成分(梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II含量)進行檢測，結果見下表8。

表5　梔子苷含量方差分析表

由表8結果表明，根據確定的工藝放大生產的3批樣品，與中試樣品測定結果相比較，在梔子主要有效成分含量結果方面，整體數據均比較接近，4組主要有效成分含量(梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II)的RSD值分別為：2.11%，1.26%，4.30%，RSD值均小于5%，說明在該工藝下放大制備梔子飲片相對穩定、可靠。由此我們認為，本研究工藝可以良好的應用于梔子飲片炮制大生產。

表6　西紅花苷-I含量方差分析表

表7　西紅花苷-II含量差分析表

注*：A代表炒制溫度，B代表炒制時間，C代表藥機轉速。

注**：相互比較*P<0.05，**P<0.01。

表8　梔子飲片中試工藝放大驗證結果(n=3)　　mg/g

3討論

梔子中含有環烯醚萜類、有機酸類、黃酮類、色素類等成分，環烯醚萜類成分具有利膽作用, 其中含量最高的梔子苷還有一定的抗炎、解熱和輕瀉作用，色素類中的西紅花苷具有祛黃、利膽及降血脂作用[2]，為梔子的主要有效成分。因此本試驗選取梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II作為炮制工藝研究考察指標。

由于梔子苷的紫外最大吸收波長為238nm，西紅花苷-I、西紅花苷-II的最大吸收波長為440nm，所以本試驗中含量測定采用波長切換技術對其進行含量測定，即0～24min為238nm，24～45min為440nm。

生梔子性味苦寒，長于清熱瀉火，涼血解毒，焦梔子苦寒之性緩和，且增強止血作用，功效涼血止血，多用于血熱吐血，尿血崩漏。梔子藥性變緩與其主要有效成分含量降低有關。本試驗通過中心組合設計，考察炒制溫度、炒制時間、藥機轉速對梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II含量影響。隨著炒制溫度的升高和炒制時間的延長，梔子中梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II含量均有下降，各因素對梔子苷含量的影響最顯著。對梔子苷含量的影響次序為：中試溫度>中試炒制時間>中試轉速>中試投料量。趙淑杰等[3]研究發現梔子經炒黃、炒焦、炒炭后梔子苷含量降低率為分別為4.63%，6.06%，43.32%，與本試驗結果相符。通過對試驗結果的分析，確定了確定得到最優條件，并通過中試驗證，表明該工藝穩定可行，為大批量生產工藝提供了研究依據。

參考文獻

[1]張留記, 劉欽松, 屠萬倩,等.Rp-HPLC色譜法同時測定不同產地梔子中梔子苷、西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量[J].中國藥房,1011,22(7):630-632.

[2]鄧穎, 郭志剛, 曾兆麟.藏紅花的藥理研究進展[J].中國中藥雜志, 2002, 27(8):565-568.

[3]趙淑杰，梁大雪.梔子及其炮制品中梔子苷的含量分析[J].中國中藥雜志，1994，19(10)：601-602.

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(收稿日期：2014-12-30)編輯：曾文雪

*基金項目:國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAI04B01)。

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A