藍莓對酒精性脂肪肝小鼠肝組織HO-1表達及抗氧化能力的影響*

?

藍莓對酒精性脂肪肝小鼠肝組織HO-1表達及抗氧化能力的影響*

網絡出版時間：2015-03-19網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1006.020.html

黃超**， 任婷婷， 王豫萍， 程明亮***

(貴陽醫學院 感染科教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究藍莓對酒精性脂肪肝(AFLD)小鼠肝組織中血紅素氧化酶-1(HO-1)表達水平及抗氧化能力的影響，探討藍莓對AFLD的保護作用及可能機制。方法： 40只C57/6J小鼠隨機均分為對照組、藍莓組、藍莓+HO-1抑制劑(鋅原卟啉，ZnPPIX)組及模型組，NIAAA法建立AFLD動物模型，油紅O染色法檢測模型建立情況及各組小鼠肝組織病理學變化；取眼眶血檢測各組小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，膽固醇(TC)含量；酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量；Western blot法檢測各組小鼠肝組織中HO-1蛋白的表達。結果： 藍莓組肝組織脂肪沉積較模型組及藍莓+ZnPPIX組明顯減少，血清中ALT、AST、TG及TC含量降低(P<0.05)，肝組織中SOD活性和GSH含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)；藍莓組HO-1蛋白表達量高于藍莓+ZnPPIX組及模型組。結論： 藍莓可減輕AFLD，其機制可能與上調小鼠肝臟HO-1的表達，增強機體抗氧化能力有關。

[關鍵詞]脂肪肝,酒精性； 藍莓； 氧化應激； 血紅素氧化酶-1； 肝功能試驗

乙醇代謝所引起的氧化應激、脂質過氧化、線粒體損傷以及細胞防御體系的激活是酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)的主要發病機制，臨床上使用抗氧化劑治療AFLD具有較好的療效[1-5]。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)對多種氧化損傷有良好的保護作用，已成為目前研究預防氧化攻擊的首選靶基因之一。藍莓中富含的花青素、多酚類和黃酮類化合物是果品中少有的特殊成分，具有明確的抗氧化活性，被稱為果蔬中“第一號抗氧化劑”。本實驗通過建立AFLD動物模型，以HO-1為研究重點，觀察在藍莓及HO-1抑制劑(ZnPPIX)干預下小鼠肝臟脂肪沉積、肝功能損傷指標、抗氧化指標及HO-1蛋白表達的變化，探討藍莓對小鼠AFLD的干預作用及可能作用機制。

1材料與方法

1.1　材料與儀器

藍莓(兔眼品種)產于麻江縣藍莓生產基地，-20 ℃保存，使用時臨時榨汁提取原漿使用；利伯DeCarli'82對照組飼料，利伯DeCarli'82損傷飼料(江蘇特洛菲飼料科技有限公司；F1259SP，F1258SP)；鋅原卟啉(ZnPPIX)溶液(Sigma公司)；谷胱甘肽(GSH)酶聯免疫分析試劑盒、丙二醛(MDA)酶聯免疫分析試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯免疫分析試劑盒(上海凱基)；HO-1兔抗鼠多克隆抗體一抗(ABCAM)，羊抗兔多克隆抗體二抗(上海基因工程)，GAPDH兔抗鼠抗體(武漢博士德生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑購(Biomiga生物有限公司)，ECL化學發光試劑(百樂公司)；顯微鏡圖像采集系統(OLYMPUS，BX41)，MSS全波長酶標儀(BioTec)，電泳儀(自北京市六一儀器廠，1DYCZ-24DN型)，高速低溫離心機(sigma3K15)；全自動生化分析儀(日本ADVIA2400)，其他試劑均用分析純。

1.2　動物分組建模

C57BL/6J雌鼠(購于貴陽醫學院動物實驗中心)40只，8~10周齡，體質量(16±2)g；小鼠適應性喂養2周，隨機均分為對照組(A組)，藍莓組(B組)，藍莓+ZnPPIX組(C組)，模型組(D組)。參照NIAAA法，對照組飼喂DeCarli'82對照飼料，其余各組飼喂DeCarli'82損傷飼料，建立AFLD模型。各組小鼠均嚴格按照說明書流程飼喂對應的利伯DeCarli'82飼料10 d。B組在飼喂損傷飼料的同時進行藍莓原漿灌胃(1.5 mL/100 g)；C組灌胃藍莓方法同B組，同時用ZnPPIX溶液(10 mg/kg)經腹腔注射。

1.3　觀察指標

造模10 d后，各組小鼠禁食水24 h，于處死動物前9 h，A組灌胃精糊(灌胃量=體質量×20 μL)，其余各組灌胃30%乙醇溶液(灌胃量=體質量×20 μL)。9 h后各組小鼠麻醉脊柱脫頸處死，取眼眶血分離血清檢測谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，膽固醇(TC)檢測。取同部位肝臟部分肝組織置于液氮中行冰凍切片液中保存用于油紅O染色檢測肝組織脂肪化，其余肝組織放入凍存管后-80 ℃凍存，用于檢測下面兩類指標：(1)肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量，以空白組為參數調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，根據標準曲線公式計算得出肝組織中相應指標。(2)肝組織HO-1蛋白表達，以GAPDH表達水平作為內參照，蛋白的表達量以HO-1蛋白與內參GAPDH對照蛋白灰度值的對比值表示。

1.4　統計學方法

2結果

2.1　小鼠肝組織脂肪化程度鑒定

除A組外，B、C、D組油紅染色均可見細胞水腫及紅色脂滴，而B、C組肝細胞內紅色脂滴明顯少于D組，B組肝細胞水腫及脂滴沉積少于C組。

A為對照組，B為藍莓組，C為藍莓+ZnPPIX組，D為模型組圖1　各組小鼠肝組織油紅O染色(×200)Fig.1　Pathological changes of mice liver in each group detected by oil red O staining

2.2　血清ALT、AST、TG及TC

A、B及C組血清中ALT、AST、TG、TC含量低于D組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組ALT、AST、TG、TC含量明顯高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC水平

(1)與D組比較，P<0.05；(2)與B組比較，P<0.05；(3)與A組比較，P<0.05

2.3　肝組織中SOD、MDA、GSH

與D組比較，A、B、C組肝組織中SOD活性、GSH水平明顯增高，MDA水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與B組比較，C組SOD活性、GSH水平明顯降低，而MDA水平明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　各組小鼠肝組織中SOD活性、

(1)與D組比較，P<0.05；(2)與B組比較，P<0.05

2.4　肝組織中HO-1蛋白表達

B、D組HO-1蛋白表達高于A組和C組差異均有統計學意義(P<0.05)； B組HO-1蛋白表達高于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與A組比較，P<0.05；(2)與C組比較，P<0.05；(3)與D組比較，P<0.05圖2　各組小鼠肝組織中HO-1蛋白的表達Fig.2　The levels of HO-1 in mice liver in each group

3討論

世界衛生組織《2014年酒精與健康全球狀況報告》 顯示，2012年全球因有害食用酒精造成330萬人死亡，超過艾滋病、肺結核、暴力事件死亡人數的總和，占全球死亡總數的5.9%，其中因酒精性肝病死亡的比例占1/2。而AFLD是酒精性肝病早期的病理改變，若能得到有效控制，將大大降低酒精性肝病的發生。乙醇在肝臟中被乙醇脫氫酶(ADH)、微粒體中的乙醇氧化系統(MEOS)以及過氧化物酶體中的過氧化氫酶分解為乙醛，而其代謝過程將使肝細胞內活性氧(ROS)和氧自由基增多；當生成的ROS和氧自由基超過SOD和GSH等抗氧化因子的清除能力時，將導致細胞的脂質過氧化造成肝細胞線粒體功能紊亂，引起肝細胞脂肪變性，進而發展為AFLD。HO-1是細胞微粒體酶，主要功能是降解血紅素生成膽綠素、CO及Fe2-，而膽綠素經膽綠素還原酶的作用生成膽紅素，二者均具有抗氧化功能；Fe2-可誘導細胞內鐵蛋白的生成，減少自由態鐵的含量發揮保護細胞效應。另一方面HO-1產生的CO則通過抑制細胞色素P450 ZE1催化活性和激活生物信號傳導，減少細胞氧化毒性損傷[10]。有研究發現，HO-1所主導的抗氧化機制與AFLD的發生發展有著密切的關系[11]。有報道稱當細胞處于應激狀態時，HO-1可作為保護性蛋白表達增加[12]。

藍莓由于其強大的抗氧化活性，被WHO/FAD列為最佳的健康食品之一[13]。近年來藍莓明確的抗氧化、抗炎作用被應用于各領域氧化損傷疾病的防治研究。本課題組在前期的動物實驗研究中證實了藍莓能夠通過提高機體的抗氧化能力對CCL4引起的急性肝損傷起到較好的保護作用[14]。推測藍莓拮抗AFLD的發生發展，機制可能與藍莓所含的活性物質可調節肝臟中HO-1蛋白的表達并改善機體氧化應激有關。

本實驗通過NIAAA法成功復制了小鼠AFLD模型。通過對藍莓組及模型組小鼠油紅染色、肝功能指標的檢測發現，藍莓組小鼠肝組織脂肪沉積明顯少于模型組，血清ALT、AST、TG、TC明顯低于模型組(P<0.05)，提示藍莓能夠拮抗乙醇代謝引起的肝損傷，減少肝組織中脂肪的沉積。另一方面，藍莓組較模型組肝組織中MDA水平下降(P<0.05)、SOD活性及GSH水平增加(P<0.05)。而MDA是脂質過氧化的終產物，能夠反映肝組織由于氧自由基過量產生所導致的細胞膜損傷程度，肝組織中GSH和SOD的含量及活性能反映肝臟抗氧化應激的水平。提示藍莓能夠增強機體的抗氧化能力，減少乙醇代謝引起的氧化應激損傷。Western blot結果還顯示，模型組HO-1的蛋白表達高于正常組(P<0.05)，表明當細胞處于氧化應激狀態時，HO-1會應激性地表達上升；藍莓組HO-1表達高于模型組(P<0.05)，提示藍莓對AFLD的保護作用可能與上調HO-1蛋白的表達進而提高機體的抗氧化能力有關。本研究進一步通過經典HO-1抑制劑ZnPPIX+藍莓處理模型小鼠，在灌胃藍莓的同時抑制HO-1的表達，觀察此條件下小鼠的肝臟脂質沉積、生化指標及抗氧化指標的變化。結果顯示，藍莓+ZnPPIX組小鼠油紅染色脂肪沉淀、肝血清損傷指標積及MDA含量明顯高于藍莓組(P<0.05)，而肝組織中HO-1蛋白的表達、SOD活性、GSH含量低于藍莓組(P<0.05)，進一步證實了藍莓對AFLD的保護作用與肝組織內HO-1的表達變化從而影響機體抗氧化能力與有關。

綜上所述，藍莓對AFLD具有較好的保護作用，其機制可能與誘導HO-1高表達，提高機體的抗氧化能力有關，而藍莓對AFLD保護作用的深入機制則有待進一步的研究。

參考文獻4

[1]Liu J,Wang L.Baclofen for alcohol withdrawal.Cochrane Database Syst Rev, 2011(1):1-18.

[2]劉梅,陸倫根.氧應激在脂肪性肝病發生中的作用.胃腸病學, 2006(4):254-256.

[3]胡成穆,曹琦,李俊.酒精性脂肪肝脂質代謝研究進展.安徽醫藥, 2012(8):1045-1047.

[4]Scaglioni F,Ciccia S,Marino M,et al.ASH and NASH.Dig Dis, 2011(2):202-210.

[5]宋健,張沐新.治療脂肪肝的藥物臨床應用評價.中國藥物化學志, 2012(5):452-455.

[6]朱子夫,馬莉.Ho-1抗氧化損傷的研究進展.醫學綜述, 2010(15):2266-2270.

[7]陳介甫,李亞東,徐哲.藍莓的主要化學成分及生物活性.藥學學報, 2010(4):422-429.

[8]Lieber CS,Decarli LM.Luquid diet technique of ethanol administration 1989 update.Alcohol Alcoholisml, 1989(3):197-211.

[9]Liu J.Ethanol and liver:Recent insights into the mechanisms of ethanol-induced fatty liver.World J Gastroenterol, 2014(40):14672-14685.

[10]Tang Y,Tian H,Shi Y,et al.Quercetin suppressed CYP2E1-dependent ethanol hepatotoxicity via depleting heme pool and releasing CO.Phytomedicine, 2013(8):699-704.

[11]Louvet A,Teixeira CF,Chobert MN,et al.Cannabinoid CB2 receptors protect against alcoholic liver disease by regulating Kupffer cell polarization in mice.Hepatology, 2011(4):1217-1226.

[12]Munoz S J,Chanez Cardenas ME.A review on hemeoxygenase-2:focus on cellular protection andoxygen response.Oxid Med Cell Longev, 2014(14):167-192.

[13]Manganaris GA,Goulas V.Berry antioxidants:small fruits providing large benefits.J Sci Food Agric, 2014(5):825-833.

[14]王豫萍,程明亮,張寶方.藍莓對急性肝損傷大鼠抗氧化能力的影響.肝臟, 2012(9):633-635.

(2015-01-04收稿，2015-02-17修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

The Influence of Blueberry on Heme Oxygenase-1 Expression and

Antioxidant Ability of Mice with Alcoholic Fatty Liver Disease

HUANG Chao, REN Tingting, WANG Yuping, CHENG Mingliang

(InstituteofInfectiousDiseases,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalcollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of blueberry on heme oxygenase-1 (HO-1) and antioxidant ability of mice with alcoholic fatty liver disease (AFLD), and to explore the protective effects of blueberry on AFLD and possible mechanism. Methods: Forty C57/6J mice were randomly divided into control group,blueberry group,blueberry+ZnPPIX group and model group. AFLD model was established by using NIAAA method, pathological changes in the hepatic tissues were detected by oil red O staining, the orbital blood was taken to detect the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST)，triglyceride (TG) and total cholesterol (TC).The superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione (GSH) levels, malondialdehyde (MDA)contents inliver tissue were quantified by ELISA.The expression of HO-1 in liver tissue was detected by Western blot. Results: Compared with model group and blueberry+ZnPPIX group, lipid accumulation in liver tissue of mice in blueberry group decreased, serum ALT, AST,TG and TC levels decreased (P<0.05).The hepatic MDA content also decreased (P<0.05), while GSH contents, SOD activity and the HO-1 levels increased (P<0.05). Conclusion: Blueberry can alleviate AFLD, the mechanism may relate to raise the expression of HO-1 in mice, increase the antioxidant capacity.

[Key words]fatty liver, alcoholic; blueberry; oxidative stress; heme oxygenase-1; liver function test

[中圖分類號]R363.1； R575.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0245-04

通信作者***E-mail:mlcheng@yeah.net.

[基金項目]**貴陽醫學院2012級碩士研究生