大鼠前扣帶皮層中PSD-95和nNOS在痛情緒中的作用

陳海軍, 徐　靜, 張傳青, 施麗燕, 萬燕杰,

(1. 徐州醫學院 江蘇省麻醉學重點實驗室, 江蘇 徐州, 221002;

2. 上海市浦東新區公利醫院 疼痛科, 上海, 200135)

大鼠前扣帶皮層中PSD-95和nNOS在痛情緒中的作用

陳海軍1, 徐靜2, 張傳青2, 施麗燕2, 萬燕杰1,2

(1. 徐州醫學院 江蘇省麻醉學重點實驗室, 江蘇 徐州, 221002;

2. 上海市浦東新區公利醫院 疼痛科, 上海, 200135)

摘要:目的探討大鼠前扣帶皮層(ACC)中PSD-95和nNOS 在痛情緒中的作用。方法40只SD大鼠隨機分為正常組(N組)、F組(福爾馬林)、NS-CPA組(生理鹽水-CPA)、F-CPA組(福爾馬林-CPA)、CCI-CPA組。完成CPA訓練后，將各組大鼠麻醉后取ACC，用Western blot方法檢測PSD-95和nNOS蛋白的表達。結果與CPA訓練前比，F-CPA組和CCI-CPA組大鼠經過出現了明顯的回避行為(P<0.05)。與NS-CPA組比較，F-CPA組、CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表達上調(P<0.05), 其中F-CPA組PSD-95的表達上調較明顯(P<0.05), 而CCI-CPA組nNOS的表達上調更明顯(P<0.05)。結論 大鼠ACC中PSD-95和nNOS表達上調可能參與了痛情緒的形成。

關鍵詞:前扣帶皮層; 痛情緒; PSD-95; nNOS

疼痛是一種與組織損傷或潛在損傷相關的不愉快的主觀感覺和情感體驗，從定義看它至少包含疼痛感覺(痛感覺)和疼痛情緒(痛情緒)兩個基本成分。痛感覺主要感受致痛刺激的屬性，包括刺激的性質、強度、位置等，也就是人們通常所說的“疼痛”；痛情緒主要涉及傷害性刺激所引起的恐懼、厭惡、焦慮、抑郁等負性情緒。目前有關疼痛的研究多集中于痛感覺，而對于痛情緒的研究不多。事實上，30%以上的慢性疼痛患者正經受著重型抑郁癥的困擾[1]。前扣帶皮層(ACC)是痛情緒形成的一個關鍵的部位，其分子基礎可能是NMDA受體[2-5]。近年來研究表明PSD-95 、nNOS參與了痛感覺的中樞敏化過程, PSD-95能夠與NMDA受體、nNOS連接組成信號復合物，在介導和整合NMDA受體信號轉導中發揮關鍵性作用[6-8], 但PSD-95、nNOS在痛情緒中的作用尚未見報道。本實驗擬在福爾馬林誘導的條件性位置回避模型(F-CPA, 反映痛情緒的模型)大鼠的ACC觀察PSD-95和nNOS的表達，為痛情緒形成機制的研究尋找新線索。

1材料與方法

1.1材料

220～280 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，由上海實驗動物研究中心提供。大鼠分籠飼養，自由攝入水和食物，室溫控制在(22±1) ℃, 24 h晝夜循環光照。條件性位置回避(CPA)訓練裝置(上海欣軟科技有限責任公司，中國)，鼠抗PSD-95單克隆抗體(1∶1 000, Millipore，USA), 兔抗nNOS單克隆抗體(1∶1 000, CST, USA)。

1.2實驗分組與處理

40只SD大鼠隨機分為5組，每組8只: ① 正常組(N組)：不做任何處理; ② 福爾馬林組(F組)：足底注射福爾馬林不進行CPA訓練; ③ 生理鹽水-CPA組(NS-CPA組)：足底注射生理鹽水且進行CPA訓練; ④ 福爾馬林-CPA組(F-CPA組)：足底注射福爾馬林且進行CPA訓練; ⑤ CCI-CPA組：大鼠慢性坐骨神經縮窄損傷(CCI, 方法參考文獻[9])14 d后進行F-CPA訓練。完成CPA訓練后各組大鼠用1.5%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)腹腔注射后斷頭取ACC, 范圍冠狀面從Bregma向前3.2 mm到1.2 mm, 左右旁開0.8 mm, 深2.6 mm。ACC取出后，稱重，放離心管液氮凍存后-80 ℃冰箱中儲存，以備Western blot檢測。

1.3行為學訓練

條件性位置回避(CPA)訓練裝由兩部分組成: ① 穿梭箱：由3個不透明的室組成，2個較大的(30 cm×30 cm×30 cm)為條件訓練室(A室、B室)，并排放置。較小的中性室(C室)(15 cm×20 cm×30 cm)位于條件訓練室前面。各室之間通過可以移動的門(10 cm×10 cm)相通。A室和B室具有不同的特征: A室四壁為黑白相間的縱形條紋，室內灑以1%醋酸溶液，底板為粗糙帶孔的塑料薄板; B室四壁為黑白相間的橫形條紋，室內灑以1%桂皮水溶液，底板為光滑帶孔的塑料薄板。C室四壁灰色，沒有特殊的條紋，也沒有特殊氣味劑; ② 記錄系統：在A室和B室頂部正中裝有攝像頭，連接計算機及顯示器，能夠隨時觀察大鼠的活動，并記錄大鼠在A、B兩室的停留時間。CPA訓練過程參照文獻[10]共4 d。條件訓練前：第1天，熟悉環境，測試大鼠在A室、B室內停留時間，作為基礎值。把大鼠放入C室，適應2 min后打開通往A、B兩室的門，當進入某一室后將門關閉，讓其在A、B兩室自由穿梭探索15 min, 記錄大鼠在A室、B室中分別的停留時間。排除標準：在某一室的停留時間超過總時間的80%(即720 s)。條件訓練：第2天，根據隨機原則，將大鼠進行平衡。關閉所有門，將大鼠隨機放入A室或B室(非福爾馬林匹配室)，停留45 min。第3天，在大鼠一側后肢足底給予50 μL 5%福爾馬林或生理鹽水(作為對照)注射后放入另一個條件室(福爾馬林匹配室)，同樣停留45 min。條件訓練后：第4天，測試。測試過程同第1天，記錄大鼠在A室、B室中分別的停留時間。

1.4Western blot檢測

將每組ACC按1 μL裂解液/100 μg組織的比例加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，勻漿后4 ℃離心30 min, 12 000 r/min, 取適量上清液BCA法測定蛋白質濃度，其余上清液放-80 ℃冰箱中備用。每組取蛋白總量為40 μg的等量樣品，加上樣緩沖液震蕩混勻，在100 ℃沸水中煮5 min。常規電泳轉膜后封閉液封閉2h，加一抗PSD-95、nNOS, 4 ℃過夜，TBS緩沖液洗5 min×3次，二抗室溫孵育2 h, 洗膜后ECL法顯色,X線底片曝光。以actin為內參照，實驗重復3次。

1.5統計學分析

2結果

2.1行為學測試

各組大鼠CPA訓練結果顯示：與CPA訓練前比較，NS-CPA組大鼠CPA訓練后在匹配室時間差異無統計學意義(P>0.05), F-CPA組和CCI-CPA組大鼠CPA訓練后在匹配室時間顯著減少，即出現了明顯的回避行為(P<0.05); 與NS-CPA組比較，F-CPA組和CCI-CPA組的大鼠的回避分數(大鼠訓練前在匹配室中停留的時間減去大鼠訓練后在匹配室中停留的時間)顯著增加(P<0.05), 見表1。

組別訓練前/s訓練后/s回避分數/sNS-CPA467.36±41.26451.96±35.5415.40±35.47F-CPA453.45±48.44172.72±44.28*280.72±42.14#CCI-CPA442.65±35.5573.32±26.13*369.33±39.01#

與訓練前比較，*P<0.05; 與NS-CPA組比較，#P<0.05。

2.2Western blot 檢測PSD-95和nNOS的表達

各組大鼠前扣帶皮層內PSD-95和nNOS的表達結果顯示: N組、F組、NS-CPA組大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表達差異無統計學意義(P>0.05); 與NS-CPA組比較, F-CPA組和CCI-CPA組大鼠ACC內PSD-95、nNOS的表達上調(P<0.05), 與F-CPA組比較, CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95的表達下調(P<0.05)，而CCI-CPA組nNOS的表達上調(P<0.05),見圖1、2。

3討論

痛情緒是人類的主觀感受，以往缺乏相應的動物模型，自從Johansen等[4]首次提出反映痛情緒的F-CPA模型后，它已被廣泛應用于實驗動物痛情緒機制的研究。但臨床工作中疼痛病人的情緒變化(厭惡、焦慮、抑郁等)往往是在經歷較長一段時間疼痛折磨之后才會顯現出來，而且經歷病痛的時間越久出現情緒障礙的概率越高。一份對494例慢性疼痛患者情緒障礙評估發現，其中36.4%表現為抑郁癥，31.4%表現為焦慮，這遠遠高于急性疼痛人群的患病率[11]。為了與使痛情緒模型更加接近臨床中的真實情況，本次實驗設計了CCI-CPA組，即大鼠在坐骨神經縮窄損傷建立起神經病理性疼痛14 d后再進行常規的F-CPA訓練。

圖1 各組大鼠前扣帶皮層(ACC)內PSD-95和nNOS的表達

注:N組、F組、NS-CPA組三組間,#P>0.05;與NS-CPA組比較,◆P<0.05;與F-CPA組比較,*P<0.05。圖2 Westernblot電泳條帶相對積分光密度值(相對于正常組)

實驗中各組大鼠在經過4 d CPA訓練，F-CPA組大鼠出現了明顯的條件性位置回避行為，說明作者成功復制了F-CPA模型，同時值得注意的是CCI-CPA組大鼠同樣產生了明顯的條件性位置回避行為。進一步的回避分數分析顯示，F-CPA組大鼠的回避分數明顯高于NS-CPA組；與F-CPA組比較，CCI-CPA組大鼠的回避分數則更為明顯。以上結果說明F-CPA組和CCI-CPA組大鼠都出現了痛情緒反應，而經歷了14 d坐骨神經結扎損傷后再進行CPA訓練的CCI-CPA組大鼠表現出更為強烈的痛情緒變化，這種情緒變化更接近于臨床工作中長期慢性疼痛病人所伴有的情緒改變[12-13]。因此，經過改良后的CCI-CPA訓練過程可能為今后探索建立更為可靠的痛情緒模型提供了線索[14-15]。

痛感覺和痛情緒分別經不同的傳導通路上行投射至中樞不同腦區, ACC已被證明是參與痛情緒的高級中樞[6, 4]在反映痛情緒的F-CPA模型大鼠ACC內出現了NMDA受體NR2A和NR2B亞基表達上調，而ACC內注入NMDA受體拮抗劑可以阻止福爾馬林誘導的條件性位置厭惡情緒的形成，但對福爾馬林引起的急性疼痛行為反應沒有影響，同時降低痛情緒導致的ACC神經元的破壞[5,16], 這些研究表明大鼠ACC內NMDA受體的激活參與了痛情緒的形成。近年來研究表明PSD-95、nNOS參與了痛感覺的中樞敏化過程[6-7]。PSD-95作為突觸后致密物中的重要結構蛋白，它一方面和NMDA受體的NR2B亞基緊密相連，同時也與nNOS的PDZ結構域連接，組成受體-信號分子-調節分子-靶分子復合物，在介導和整合NMDAR信號轉導中具有關鍵性作用[8]。因此，作者推測ACC中的PSD-95和nNOS可能參與了痛情緒形成[17-18]。

本實驗中F-CPA組組大鼠產生了強烈的條件性位置回避行為，說明成功復制了痛情緒模型，同時觀察到F-CPA組和CCI-CPA組大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達顯著增加；而只給予痛刺激不進行CPA訓練(F組)或只進行訓練不給予痛刺激(NS-CPA組)都沒有引起PSD-95、nNOS的表達上調；這些結果表明，大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達上調可能參與了痛情緒的形成。此外，從行為學結果看CCI-CPA組大鼠同樣出現了明顯的條件性位置回避行為，即產生了痛情緒。而與F-CPA組比較，CCI-CPA組大鼠ACC中nNOS的表達增加，PSD-95的表達雖有下降，但仍高于沒有出現痛情緒反應的F組和NS-CPA組，這進一步說明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達上調可能參與了痛情緒的形成[19]。

總之，此實驗觀察到在出現痛情緒反應的F-CPA和CCI-CPA組大鼠ACC 內PSD-95和nNOS表達顯著上調，這說明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表達上調可能參與了痛情緒的形成，其具體機制有待于進一步研究。

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Role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion

in anterior cingulate cortex of rats

CHEN Haijun1, XU Jing2, ZHANG Chuanqing2, SHI Liyan2, WAN Yanjie1,2

(1.KeyLaboratoryofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221002;

2.DepartmentofPain,PudongGongliHospital,Shanghai, 200135)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion in anterior cingulate cortex (ACC) of rats. Methods40 SD rats were randomly divided into group N (normal group), group F (formalin), NS-CPA group (saline-CPA), F-CPA group (formalin-CPA) and CCI-CPA group. After CPA training, the rats were terminally anesthetized and the ACC was rapidly removed, and then the expression of PSD-95 and nNOS in the anterior cingulate cortex were measured by Western blot. ResultsCompared with CPA before training, there was a clear avoidance behavior in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05). Compared with NS-CPA group, the protein expressions of PSD-95 and nNOS were significantly up-regulated in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05), while the PSD-95 was much higher in the F-CPA group(P<0.05), and the nNOS was much higher in the CCI-CPA group(P<0.05). ConclusionUp-regulation of PSD-95 and nNOS in anterior cingulate cortex in rats may be involved in the development of pain-related aversion.

KEYWORDS:anterior cingulate cortex; pain-related aversion; PSD-95; nNOS

通信作者:萬燕杰, E-mail:yanjiewan@sina.com

收稿日期:2014-11-17

中圖分類號:R 338.3

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)03-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201503001