結核潛伏感染蛋白Rv1737c B細胞、CTL及Th表位預測與分析

白雪娟, 趙亞靜, 梁　艷, 吳雪瓊

(解放軍第309醫院 全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室/

結核病診療新技術北京市重點實驗室, 北京, 100091)

結核潛伏感染蛋白Rv1737c B細胞、CTL及Th表位預測與分析

白雪娟, 趙亞靜, 梁艷, 吳雪瓊

(解放軍第309醫院 全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室/

結核病診療新技術北京市重點實驗室, 北京, 100091)

摘要:目的利用生物信息學方法建立一套預測B細胞、CTL及Th細胞免疫功能多肽的方法，用于篩選新型結核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原。方法采用DNAStar軟件包中的Protean軟件從α螺旋、β折疊及轉角等二級結構的數量和分布、親水性和表面可及性等方面預測分析該蛋白序列成為B細胞表位的可能性，預測CTL表位時，先采用Blast方法分析該序列與人類序列的同源性，然后綜合應用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL預測其CTL表位，應用RANKPEP及SYFPEITHI超基序法遠程預測Th細胞表位，篩選表位集中、分值較高者作為候選多肽片段。結果Protean軟件預測結果表明Rv1737c蛋白序列親水性和表面可及性都較弱, α轉角、β折疊結構數目較多且分布廣泛，而轉角及卷曲結構較少，B細胞表位數目較少; Rv1737c蛋白的CTL及Th表位主要集中于第100位氨基酸之后，其中與HLA-A2表型相對的CTL表位，與HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型相對的Th表位較其他表型數目較多、分值較高。結論Rv1737c蛋白可能不利于作為B細胞抗原，但其可能是一種較好的T細胞抗原，成為結核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原。

關鍵詞:結核分枝桿菌; Rv1737c; 表位預測; 生物信息學

Epitope prediction and analysis of Rv1737c protein of

結核病是因感染結核分枝桿菌(M.tb)所致的危害全球人類健康的主要傳染病之一[1]。據報道[2-3]全球約有20億人感染結核分枝桿菌，其中約90%感染者為潛伏期感染，而大多數活動性結核病是由潛伏感染的結核桿菌重新激活所致。因此，結核潛伏者感染的篩查與防治對于控制結核病的發生有著重要意義。Rv1737c抗原是Voskuil等[4]利用基因芯片技術發現48個與缺氧相關的結核分枝桿菌潛伏感染抗原之一，其編碼一種硝酸鹽和/或亞硝酸鹽轉運蛋白。有研究[5-6]表明，與活動性結核患者相比，該抗原更易被結核分枝桿菌潛伏感染人群外周血中的淋巴細胞識別；另外其在所有卡介苗菌株中表達缺失，由此推測如將抗原Rv1737c用于結核分枝桿菌潛伏感染診斷，有可能與接種卡介苗者相區分[7]。因此，本研究選擇Rv1737c抗原作為靶點，采用生物信息學方法，應用目前使用較多且較成熟的在線及離線預測工具對其進行B細胞、CTL及Th表位預測，試圖找到表達具有優勢抗原表位的特異性片段。

1材料與方法

1.1材料

Rv1737c蛋白序列來源于網站http://www.tbdb.org/, 生物信息學分析軟件及網站來源于internet網絡資源，具體如下所述：

1.1.1B細胞表位預測：采用美國DNASTAR公司產品DNA Star軟件包中Protean軟件，可將其安裝于計算機上進行DNA和蛋白質分析。

1.1.2CTL表位預測: Blast分析: http://web.expasy.org/blast/; SYFPEITHI超基序法遠程預測：http://www.syfpeithi.de/; BIMAS量化基序法預測: http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/; NetCTL預測: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/。

1.1.3Th表位預測: RANKPEP預測：http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/; SYFPEITHI超基序法遠程預測: http://www.syfpeithi.de/。

1.2方法

1.2.1DNA star分析：篩選時依據親水性好(hydrophilicity), 表面可及性高(accessibility)，柔韌性好(flexibility)，抗原性強(antigenic index), 卷曲(coils)和轉角(turns)可能性大的為候選B細胞表位，盡量避開α螺旋、β折疊結構。

1.2.2CTL表位分析：BLAST分析：采用EXPASY在線軟件(NCBI BLAST2 service)對Rv1737c蛋白氨基酸序列與人類蛋白質的同源性進行分析，在EXPASY主頁http://web.expasy.org/blast/，輸入Rv1737c蛋白的氨基酸序列，選擇Homo sapiens，進行blast比對。

SYFPEITHI超基序法遠程預測CTL表位：進入SYFPEITHI主頁http://www.syfpeithi.de/, 選擇Epitope prediction進入CTL表位預測界面，對Rv1737c的HLA-A* 0201、HLA-A*03和HLA-B*0702限制性CTL表位進行遠程預測。對分值較高(≥18分)的九肽做進一步分析。

BIMAS量化基序法預測CTL 表位：進入BIMAS主頁http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/, 選定預測抗原肽長度為9, MHC類型為HLA-A*0201、HLA-A*3和HLA-B*7, 將已獲得的抗原氨基酸全長輸入待預測序列框，運行遠程預測程序，獲得預測結果。

NetCTL預測CTL表位：進入NetCTL主頁http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/, 選定A2、A3、B7表型，輸入氨基酸序列后進行在線預測，選取綜合預測值(COMB)>0.75的九肽為候選CTL表位。

1.2.3Th表位分析: RANKPEP分析：進入RANKPEP主頁http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html, 選擇MHC類型為HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501的限制性Th細胞表位預測，選取紅色標記的潛在可能表位序列。

SYFPEITHI超基序法遠程預測Th表位：進入SYFPEITHI主頁http://www.syfpeithi.de/, 選擇Epitope prediction進入CTL表位預測界面，主要對HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*08、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*13及HLA-DRB1*15限制性Th細胞表位進行預測。對分值較高(≥18分)的由15個氨基酸構成的表位多肽作分析。

2結果

2.1Rv1737c蛋白B細胞抗原表位的DNA star預測分析結果

利用DNA star軟件包中的Protean軟件，結合Gamier-Robson和Chou-Fasman兩種方法預測Rv1737c蛋白的二級結構，以β折疊較多，分布較均勻，分值較高且位置集中的氨基酸殘基位于6-23、72-92、97-118、142-171、173-184、204-224、229-243、300-312、364-385位; α螺旋結構也較多，主要集中位于33-42、70-80、162-186、196-203、249-259、274-293、386-395位氨基酸殘基；轉角結構相對較少，位于120-124、130-132、190-191、261-263、344-345；無規則卷曲結構位于25-29、107-108、158-163、192-193、228-230、291-295、313-314、325-327位氨基酸殘基，數目也較少，分布比較散。用Kyte-Doolittle方法分析Rv1737c蛋白的疏水性和親水性，結果顯示該蛋白主要表現為疏水性，親水性區域較短且分散，僅以1-5、32-42、64-70、127-132、195-203、243-247、268-271、323-327、357-363、384-395位氨基酸殘基處的親水性指數較高，提示這些區域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大。用Emini方法預測蛋白的表面可及性，顯示該蛋白呈現在表面可能性較大的區域主要僅集中于1-34、63-65、123-131、184-192、268-270、292-295、323-325、355-363、385-390、392-395位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現為負值。Rv1737c蛋白含有較多的柔韌性區域且分布較均勻，位于27-32、39-41、60-70、126-134、183-185、190-199、246-248、260-263、292-296、313-316、331-334、342-344、365-363、386-392位氨基酸殘基，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級結構。

圖1 應用DNAstar軟件分析Rv1737c蛋白序列結果

2.2Rv1737c蛋白CTL表位預測分析結果

對Rv1737c蛋白氨基酸序列與人類蛋白質的同源性進行blast分析，結果表明該蛋白與人類蛋白質序列一致率低，同源性較差。將Rv1737c蛋白序列輸入3種CTL表位分析軟件，選擇HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7三種MHC限制類型，預測9個氨基酸長度的T細胞表位，表1列出由3種方法預測的分值較高且有候選意義的CTL表位數目情況；表2綜合考慮3個軟件的預測結果，針對每一種表型，篩選出分值較高的多肽序列。

2.3Rv1737c蛋白Th表位預測分析結果

將Rv1737c蛋白序列輸入2種Th表位分析軟件，選擇HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501限制性Th細胞表位預測，獲得9個或15個氨基酸長度的T細胞表位，表3列出由2種方法預測的分值較高且有候選意義的Th表型表位數目情況；表4綜合考慮2個軟件的預測結果，篩選出針對某個表型分值均較高的Th表位序列。

3討論

表1　不同在線預測工具對抗原Rv1737c的CTL表位綜合分析結果

表2　綜合分析Rv1737c蛋白獲得的候選CTL表位序列信息

表3　不同在線預測工具對Rv1737c抗原Th細胞表位的綜合分析

表4　綜合分析Rv1737c蛋白獲得的候選Th表位信息

隨著生物信息學的快速發展，通過生物信息學軟件和網站對相關信息進行分析、處理、模擬，最終預測抗原表位的模式，已為越來越多的研究者所采用[8-9]。因為這樣的研究方式可以減少實驗的盲目性，加強實驗的目的性，大大提高實驗的成功率[10]。表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，表位的免疫學特性研究可以幫助研究者們更好地認識抗原在機體內的免疫機制，以之為基礎的診斷試劑和疫苗開發也成為近年來研究的熱點[11-12]。開發結核潛伏感染相關抗原表位為深入研究潛伏感染機制，發現新的潛伏感染診斷標志物及有效的潛伏感染表位疫苗的研究奠定了基礎。

蛋白質的二級結構與B細胞表位關系密切。維持α螺旋、β折疊結構的化學鍵能較高，穩定性強，造成這些結構很難較好地與抗體嵌合，且經常處于蛋白質內部，因而很少成為抗原表位。β轉角和無規則卷曲結構單元是比較松散的柔性結構，易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有B細胞的優勢表位[13-14]。通過DNAstar分析，作者發現蛋白Rv1737c整體親水性和表面可及性都較弱，α轉角、β折疊結構數目較多且分布廣泛，而轉角及卷曲結構較少，這些因素都不利于將其作為B細胞抗原。將Rv1737c蛋白序列輸入3種CTL表位分析軟件，選擇不具種族特異性的高頻MHC-I類等位基因HLA-A2[15-17], 聯合HLA-A3和HLA-B7限制類型，預測CTL細胞表位，發現CTL表位集中于第100位氨基酸之后，且與HLA-A3和HLA-B7兩種表型相比較，針對HLA-A2表型的表位數目最多，分值較高。組合HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7這3個超型的限制性表位，在黑人、白人和亞裔人中涵蓋率達到90%[18-19]。因此，聯合應用HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7 3個超型的限制性表位，可以誘導針對不同HLA基因位點的CTL反應，從而大大拓寬免疫反應人群。SYFPEITHI和BIMAS數據庫篩選是進行CTL表位預測運用最多的方法，但這兩種方法并沒考慮抗原肽提呈效率因素，而NetCTL考慮到了這一因素，因此將這三種方法綜合進行分析，可以提高表位預測的準確率，減少后續實驗驗證的表位數目[18]。

HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501是中國人群常見的表型[20-21]，用兩種Th表位分析軟件對上述表型進行預測，發現RANKPEP較SYFPEITHI提供更多的預測表位類型，綜合兩種方法預測結果，發現得分較高的候選Th型表位多數(14/20)亦集中于100位氨基酸之后；針對HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型的表位數目最多，分值較高；對于HLA-DRB1*0401表型, SYFPEITHI較RANKPEP預測獲得表位數目更多，且兩種方法獲得得分高的表位序列的一致性較高。由此可見，Rv1737c蛋白序列以T細胞表位為主，且Th與CTL表位位置集中于100位氨基酸之后，這一結果與DNAstar初步分析結果一致，這兩種表位之間僅有一條序列一致，其余都不相同。

Riano等[5]發現DosR抗原Rv1737c能在潛伏感染個體中誘導產生較之活動性結核患者中更高水平的IFN-γ; 在南非烏干達結核分枝桿菌潛伏感染者中免疫原性也比較好, ELISA方法檢測顯示外周血中IFN-γ的水平較高[6]。這些結果提示該抗原可能與潛伏感染維持和保護結核再感染相關。Rv1737c蛋白有可能是一種較好的T細胞抗原，本研究預測結果與文獻報道比較一致。

本文通過生物信息學方法對Rv1737c蛋白進行預測分析，盡可能多地搜索和了解該蛋白的結構與功能的信息。在表位預測和結合力分析方面充分考慮了多種軟件對MHC-I及Ⅱ類分子對多肽的限制性問題，權衡分析各項結果，為結核病防治篩選新的診斷抗原分子和候選疫苗抗原，為實驗研究和應用前景分析提供信息，但篩選得到的候選表位肽是否能有效刺激T細胞免疫應答，還有待于下一步體外、體內實驗的進一步驗證。

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mycobacterium tuberculosis dormant infection

on B cell, CTL and Th cells cells n on

BAI Xuejuan, ZHAO Yajing, LIANG Yang, WU Xueqiong

(InstituteforTuberculosisResearch,ArmyTuberculosisPreventionandControlKey

Laboratory,BeijngKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisand

Treatment,the309thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Beijing, 100091)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a method of predicting immune function polypeptides of B cells, CTL and Th cells for screening new TB diagnostic antigens and vaccine candidates by means of bioinformatics.MethodsSequences of proteins of B cell epitopes predicted by Protean software of DNAstar software package by the quantity and distribution from two dimensional structures of α-helix, β-pleated sheet and rotation structures. To predicte CTL epitopes, the sequence homology with the human sequence using Blast method, then the CTL epitopes were predicted by means of combination analysis of SYFPEITHI supermotif method, BIMAS quantitative motif method and NetCTL prediction method. The Th epitopes were predicted by RANKPEP and SYFPEITHI supermotif prediction method. The epitopes with higher concentration and higher scores were taken as the candidate polypeptides. ResultsProtean software showed that the hydrophilicity and surface accessibility of Rv1737c protein sequence were weak, the alpha angle and beta folding structures were more in number and distributed widely, and the angle and coil structure was less, the B cell epitopes were rare. The epitopes of Rv1737c protein on CTL and Th were concentrated after the 100th amino acid, in which

phenotypes of HLA-A2 corresponding with CTL, HLA-DRB1*0401 and HLA-DRB1*1501

corresponding with Th had more numbers and higher scores. ConclusionRv1737c protein may not benefit to be B cell antigen, but it may be a better T cell antigen for tuberculosis diagnosis marker and vaccine candidate.

KEYWORDS:mycobacterium tuberculosis; Rv1737c; epitopes prediction;bioinformatics

通信作者:吳雪瓊, Email: wu-xueqiong@263.net

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號:R 519

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)03-005-05

DOI:10.7619/jcmp.201503002