人骨髓間充質干細胞TGFβ-1基因沉默對肝癌細胞的影響

李天然, 趙紹宏, 周軍, 魏正茂, 霍天龍, 盧光明

(1. 南京軍區福州總醫院第一附屬醫院 放射科, 福建 莆田, 351100;

2. 北京大學人民醫院 放射科, 北京, 100044;

3. 解放軍總醫院第一附屬醫院 放射科, 北京, 100048;

4. 南京總醫院 放射科, 江蘇 南京, 210002)

人骨髓間充質干細胞TGFβ-1基因沉默對肝癌細胞的影響

李天然1,3, 趙紹宏1, 周軍1, 魏正茂2, 霍天龍2, 盧光明4

(1. 南京軍區福州總醫院第一附屬醫院 放射科, 福建 莆田, 351100;

2. 北京大學人民醫院 放射科, 北京, 100044;

3. 解放軍總醫院第一附屬醫院 放射科, 北京, 100048;

4. 南京總醫院 放射科, 江蘇 南京, 210002)

摘要:目的探討人骨髓間充質干細胞(hMSC)TGFβ-1基因沉默對對肝癌細胞的影響。方法構建TGFβ-1為靶向基因的mRNA和siRNA表達質粒，病毒轉染。Transwell 法檢測MHCC97-H侵襲能力。細胞計數法 (CCK-8)檢測細胞增殖能力。PCR檢測腫瘤轉移相關因子OPN表達，并分析與腫瘤侵襲的關系。結果hMSC基因沉默成功, TGFβ-1表達降低。共培養實驗結果顯示，實驗組MHCC97-H細胞的增殖能力前后比較無顯著(P>0.05)。侵襲性實驗結果顯示，實驗組具有明顯的促進肝癌細胞侵襲的作用(P<0.05), 且hMSC組較TGFβ-1沉默hMSC組更能促進肝癌細胞侵襲的作用(P<0.001)。共培養后腫瘤細胞的OPN表達下降。腫瘤細胞的OPN表達與腫瘤細胞的侵襲性呈顯著正相關。結論TGFβ-1基因沉默對肝癌細胞的增殖能力無明顯影響，對肝癌細胞的侵襲能力具有明顯促進作用，肝癌細胞OPN表達變化不是肝癌侵襲能力變化的關鍵因子。

關鍵詞:人骨髓間充質干細胞; 基因沉默; 骨橋蛋白; 高轉移潛能肝癌細胞

Influence of TGFβ-1 gene silencing of human bone

腫瘤細胞的生長和轉移涉及多基因變化和相互作用，生長和轉移抑制基因可能在抑制腫瘤轉移過程中發揮重要作用。人腫瘤轉化生長因子基因(TGF)其作用包括調節細胞增殖和轉移。TGF家族中TGFβ-1對腫瘤細胞的生長具有促進和抑制雙重生物學效應，在腫瘤發生早期, TGFβ-1通過抑制腫瘤細胞生長而抑制轉移的發生，隨著腫瘤的發展, TGFβ-1轉變成腫瘤生長刺激因子，促進轉移[1-2]。基于TGFβ-1生物學特性，本研究設計利用基因修飾技術將骨髓間充質干細胞(hMSC)中的TGFβ-1基因沉默，使hMSC低表達TGFβ-1，觀察經基因修飾的hMSC對高轉移潛能肝癌細胞的影響，為基于自體干細胞移植的生物治療提供探索性研究。

1材料與方法

1.1實驗用細胞株、儀器與試劑

人骨髓間充質干細胞(hMSC)由賽業(廣州)生物科技有限公司提供，人高轉移潛能肝癌細胞(MHCC97-H), 購自上海復旦大學肝癌研究所提供。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司1X71), 二氧化碳孵箱(Nuaire公司NU4750E)。轉染試劑: Lipofectamine 2000，轉染細胞: 293FT, 培養液: H-DMEM+10% FBS，轉染混合液: Opti-MEMI。

1.2質粒構建

構建以人TGFβ-1為靶向基因的mRNA和siRNA表達質粒, pLenti X1 Puro-shTGFβ-1-eGFP, 以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因。

1.3病毒包裝

取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個10 cm的培養皿5×106個細胞數接種于培養皿中, 37 ℃, 5% CO2的培養箱中培養過夜; 24 h轉染前去除舊的培養液，加入5 mL新鮮的含10%血清DMEM培養液；制備DNA-Lipofectamine 2000復合物。將DNA-Lipofectamine 2000復合物逐滴添加到293FT細胞中，輕輕地前后搖晃培養皿以混勻復合物。放置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中過夜培養；轉染后24 h, 更換10 mL含10%血清DMEM培養液。放置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中繼續培養；轉染后48 h收集培養上清進行濃縮；加入10 mL新鮮的培養液繼續培養，轉染后72 h再次收集濃縮。

1.4結晶紫染色計算病毒滴度

去除培養液，用PBS洗滌細胞2次。加入中性甲醛，每孔0.5 mL, 固定30 min; 去除中性甲醛，用PBS洗滌細胞2次，加入結晶紫染色液(6孔板每孔0.5 mL), 并放置室溫孵育10 min; 去除染色液，用PBS洗滌細胞2次；計數被染成藍色的克隆數目，并計算病毒滴度。

1.5MHCC97-H與hMSC/shTGFβ-1轉導

細胞的共培養實驗方法

研究分為實驗組和對照組。 實驗組設2組，MHCC97-H細胞與hMSC共培養組，和MHCC97-H細胞與shTGFβ-1基因沉默hMSC共培養組，空白對照組為MHCC97-H細胞與培養基共培養。

1.5.1Transwell法MHCC97-H侵襲能力檢測：取BD基質膠，用完全培養基稀釋，按8.68 μg/cm2的濃度鋪至Transwell六孔板的上室, 37 ℃孵育2 h, 吸去BD基質膠。復蘇肝癌細胞MHCC97-H培養，常規培養48 h, 換液，備用。hMSC或hMSC/shTGFβ-1培養培養至第3代，備用。實驗組將培養hMSC或hMSC/shTGFβ-1按1×106濃度接種于Transwell共培養系統下室，再將Transwell的上室置于孔中，在上室內接種MHCC97-H細胞，使上下室的培養液相互融通，建立起hMSC或hMSC/shTGFβ-1與MHCC97-H細胞的共培養體系。對照組MHCC97-H按1×106濃度接種于Transwell共培養系統的上室，Transwell下室加入單純DMEM培養基為對照。實驗組與對照組實驗細胞培養48 h，分別取出共培養上室，吸去上室的培養基，并用PBS洗2次；用預冷的多聚甲醛固定上室的細胞，室溫固定30 min, 吉姆薩染色30 min后，用純凈水漂洗干凈，計數上室遷移至Matrigel膜下的細胞數，顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍攝(200倍)，計數每個視野的平均細胞數量，細胞計數作為MHCC97-H細胞侵襲能力檢測的指標。

1.5.2細胞計數(Cell Counting Kit-8)法MHCC97-H增殖能力檢測：待下室細胞(hMSC或hMSC/shTGFβ-1)均貼壁后，96孔板上室每孔2×103的細胞量進行接種MHCC97-H細胞，共培養48 h后，取出上室板，每孔加入8 μL的CCK-8溶液, 37 ℃孵育4 h, 孵育完畢后，進行吸光度值(OD)450 nm讀數。

1.6實時定量基因擴增熒光檢測系統qPCR

檢測

首先檢測經TGFβ-1基因修飾的hMSC TGFβ-1的表達。然后，檢測經基因修飾的hMSC與MHCC97-H細胞共培養前后轉移相關因子OPN的表達變化。

1.6.1引物設計序列：引物序列來自GenBank數據庫，由賽業(廣州)生物科技公司合成。

① 以人肌動蛋白β-Actin作為內參照物(internal control)

Forward primer: 5′-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3′;

Reverse primer: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

② 人腫瘤生長因子(TGFβ-1):

Forward primer: 5- AGTGGTTGAGCCGTGGAG-3

Reverse primer: 5-TGCAGTGTGTTATCCCTGCT-3;

③ 人骨橋蛋白(OPN):

Forward primer: 5′-TCACCAGTCTGATGAGTCTCAC-3′;

Reverse primer: 5′-CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGAT-3′

1.6.2實驗方法: MHCC97-H細胞的RNA提取，細胞裂解，加入200 μL氯仿，離心； 吸取400 μL上層水相，加入500 μL的異丙醇，離心，去廢液，加入1 mL無水乙醇洗滌RNA沉淀；離心，去廢液；加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。合成cDNA：在去除了DNA污染的RNA樣品中加入oligo (dT)18 primer 1 μL, 70 ℃孵育5 min; 按照順序加入: 5× reaction buffer 4 μL; 10 mmol/L dNTP mix 2 μL; RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL; 37 ℃孵育溫浴5 min; 加入RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 1 μL; 42 ℃孵育60 min, 70 ℃孵育10 min。特異性引物聚合酶鏈反應(PCR)擴增相應的cDNA。PCR條件: 預變性95 ℃, 5 min; 變性94 ℃, 30 s, 退火58 ℃, 30 s, 延伸72 ℃, 30 s, 共40個循環, 最后72 ℃, 10 min。PCR產物電泳并經凝膠電泳處理系統掃描半定量分析。

2結果

2.1TGFβ-1基因沉默hMSC實驗結果

qPCR檢測TGFβ-1沉默基因hMSC前后TGFβ-1基因表達： 以hMSC組TGFβ-1表達為100%, TGFβ-1沉默基因hMSC表達為83.83%, 差異有統計學意義(P<0.001), 表明hMSC基因沉默成功。

2.2CCK-8法檢測hMSC及基因沉默hMSC

細胞對MHCC97-H細胞增殖能力的影響

以MHCC97-H細胞作為空白對照，TGFβ-1基因沉默hMSC組OD值(0.303±0.02), hMSC共培養組(0.36±0.04), 空白對照組(0.31±0.07), 組間比較無顯著差異(F=2.274,P=0.137), 兩實驗組與對照組比較均無顯著差異(見圖1)。

圖1 經基因修飾前后的hMSC與MHCC97-H細胞共培養前后增殖能力比較

結果顯示，hMSC與MHCC97-H細胞共培養后，與對照組比較無顯著差異(P>0.05), TGFβ-1沉默hMSC組與MHCC97-H細胞培養后，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。表明經基因修飾前后的hMSC對MHCC97-H細胞增殖能力無影響。

2.3Transwell法hMSC及TGFβ-1沉默hMSC

細胞對MHCC97-H細胞侵襲能力的影響

采用細胞計數法進行定量。TGFβ-1基因沉默hMSC組侵襲細胞數(52.00±12.52)個/視野，hMSC共培養組(70.33±19.11), 空白對照組(27.00±7.80), 組間比較有顯著差異(F=14.617,P=0.000), 兩組實驗組與對照組比較均有顯著差異(P< 0.05)(見圖2)。

**P<0.001;*P<0.05圖2 經基因修飾前后的hMSC與MHCC97-H細胞共培養前后侵襲能力比較

結果顯示, hMSC與MHCC97-H細胞共培養后，與對照組比較具有明顯的促進肝癌細胞侵襲的作用(P<0.001), TGFβ-1沉默hMSC組與MHCC97-H細胞培養后，與對照組比較也具有促進細胞侵襲的作用(P<0.05), 且hMSC較TGFβ-1沉默hMSC組更能促進肝癌細胞侵襲的作用(P<0.05)。

2.4TGFβ-1沉默hMSC與MHCC97-H共培養前后, MHCC97-H細胞侵襲結果與轉移相關因子OPN表達間的相關性分析

PCR結果顯示，共培養后MHCC97-H細胞OPN表達均有所下降，以MHCC97-H細胞表達為100%, hMSC共培養組OPN表達為63.96%, shTGFβ-1沉默hMSC組為17.10%。shTGFβ-1沉默hMSC組MHCC97-H細胞OPN表達與侵襲細胞數量呈明顯的正相關性(r=0.865,P=0.026); hMSC組MHCC97-H細胞OPN表達與侵襲細胞數量呈明顯的正相關性(r=0.945,P=0.004)(見圖3)。

圖3MHCC97-H細胞OPN表達與侵襲細胞數量的相關散點圖

結果顯示, hMSC在基因修飾前后共培養后影響MHCC97-H細胞OPN的表達。OPN與MHCC97-H細胞的侵襲數量呈明顯的正相關性。

3討論

siRNA干擾是從mRNA水平阻斷功能基因表達的新技術，在基因功能的研究和臨床靶向治療中的應用日益廣泛[3-5]。對hMSC進行基因修飾，觀察經基因修飾的hMSC對腫瘤的影響，為以自體干細胞移植為重點的生物治療提供基礎實驗依據[6]。轉化生長因子β1(TGFβ-1)是一種具有多種功能的細胞因子。研究認為TGFβ是細胞生長抑制因子,可抑制上皮細胞的增殖，對細胞周期的調控是TGFβ細胞生長抑制作用的重要機制，對于不同類型的細胞調控的具體機制也不同，細胞逃逸TGFβ的生長抑制作用而導致細胞增殖失控、腫瘤發生[7]。然而，腫瘤發生后, TGFβ成為促進腫瘤生長的因子，TGF-β主要通過免疫抑制逃逸、增加血管生成、增加腫瘤細胞與胞外基質的相互作用來促進腫瘤的侵襲和轉移[8-9]。

基于hMSC是基因良好載體這一特性，通過基因修飾技術改變hMSC細胞中TGFβ-1基因，使TGFβ-1因子表達下降，觀察經基因修飾的hMSC細胞對高轉移潛能肝癌細胞(MHCC97-H)的影響。實時PCR檢測結果顯示實驗組hMSC中TGFβ-1表達下降，表明hMSC中TGFβ-1基因沉默成功。本實驗結果顯示，hMSC在TGFβ-1基因沉默前后對MHCC97-H細胞增殖能力無明顯影響，表明外源性TGFβ-1表達(hMSC分泌)變化對腫瘤細胞(MHCC97-H)增殖無明顯作用，這與文獻報道的腫瘤患者主要是通過TGFβ-1的自分泌促進腫瘤細胞的生長的結論相一致[10-11], 只有MHCC97-H細胞分泌的內源性TGFβ-1因子的變化才會影響腫瘤細胞的增殖。也有研究[12]認為，腫瘤表面TGFβ受體缺失或功能異常，導致TGFβ-1正常促進或抑制腫瘤增殖的功能失調。

Transwell侵襲小室技術是利用Matrigel模擬天然基底膜結構,觀察具有侵襲和遷移能力的細胞在趨化劑誘導下穿過多孔濾膜的情況[13-14]。MHCC97-H侵襲性實驗結果顯示，MHCC97-H與hMSC細胞共培養后，侵襲能力明顯增強, TGFβ-1基因沉默hMSC對MHCC97-H侵襲能力仍然明顯高于空白對照組，表明hMSC具有促進肝癌細胞侵襲的作用[15]。腫瘤細胞的侵襲能力依賴于細胞間連接的丟失和成纖維細胞特性的獲得, 此過程被稱為上皮間質轉化(EMT)[16]。TGF-β信號通路介導的EMT被認為促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移。TGF-β通過上調細胞外基質纖溶酶激活因子(PA), 如尿激酶(uPA)降解細胞外基質,促進腫瘤細胞的轉移[17-18]。因此，外源性的TGF-β可能通過上述因子，促進實驗中Matrigel膜的溶解起到促進細胞侵襲的作用。

OPN檢測結果提示, OPN與腫瘤的侵襲性呈正相關，這與文獻報道相一致[19-20]。在本研究中，共培養后, MHCC97-H細胞OPN表達下降，而腫瘤細胞的侵襲性明顯增高，說明腫瘤侵襲行為是多因素共同作用的結果，非單一因素作用結果。

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marrow mesenchymal stem cells on liver cancer cells

LI Tianran1,3, ZHAO Shaohong1, ZHOU Jun1,

WEI Zhengmao2, HUO Tianlong2, LU Guangming4

(1.DepartmentofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofFuzhouGeneralHospital

ofNanjingMilitaryCommand,Putian,Fujian, 351100; 2.DepartmentofRadiology,

ThePeople′sHospitalofPekingUniversity,Beijing, 100044; 3.DepartmentofRadiology,

TheFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPeople′sLiberationArmy,Beijing,

100048; 4.DepartmentofRadiology,NanjingGeneralHospital,Nanjing,Jiangsu, 210002)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of TGFβ-1 gene silencing of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSC) on liver cancer cells. MethodsExpression plasmid of mRNA and siRNA by taking TGFβ-1 for targeted gene was constructed and infected by virus. Transwell assay was used to evaluate invasive ability of MHCC97-H cells. CCK-8 assay was used to evaluate proliferative capacity of MHCC97-H. PCR assay was used to detect OPN expression of MHCC97-H cells, and its correlation with the tumor invasion was analyzed as well. ResultsThe gene silencing was successful. Down-regulation of TGFβ-1 expression was observed in experimental group. Co-culture results showed that there was no significant difference of proliferative capacity of the MHCC97-H cells before and after trial in the experimental group(P>0.05). Invasive experiment results showed that the experimental group had a significant function on promotion of MHCC97-H cell invasion

福建省自然基金資助項目(2013J01392)

(P<0.05), and hMSC group had a more significant function on promotion of MHCC97-H cell

invasion than TGFβ-1 hMSC group(P<0.001). OPN expression of MHCC97-H cells decreased after co-culture. The OPN expression of tumor cells was positively correlated with tumor cell invasion. ConclusionTGFβ-1 gene silencing has no significant effect on proliferation ability of MHCC97-H cell, but has significant effect on invasive ability of MHCC97-H cell. Change of OPN expression in liver cancer cell is not the key factor of invasion ability change of liver cancer.

KEYWORDS:human bone marrow mesenchymal stem cells; gene silencing; osteopontin; high metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells

通信作者:盧光明, E-mail: cjr.luguangming@vip.163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81271607); 南京軍區醫藥衛生重點項目資助(11Z035);

收稿日期:2014-11-23

中圖分類號:R 735.7

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)03-010-05

DOI:10.7619/jcmp.201503003