DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元的作用觀察

陽群芳，魏玉玲，楊俊卿

（重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016）

DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元的作用觀察

陽群芳，魏玉玲，楊俊卿

（重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016）

中國圖書分類號：R-332；R155.52；R322.81；R338.1；R348.4；R977.9

摘要：目的 建立麥芽酚鋁致原代培養大鼠海馬神經元損傷模型，探討DP2干預對鋁負荷原代海馬神經元的作用。方法選取孕期18 d左右的SD大鼠，離體培養胎鼠海馬神經元，d 7進行NSE免疫組化鑒定，并給予Al（malt）3建立鋁負荷致原代培養大鼠海馬神經元損傷模型，同時分別給予DP2激動劑DK-PGD2和DP2拮抗劑CAY10471進行干預。繼續培養24 h后，檢測各組海馬神經元MTT值、LDH漏出率和Ca2＋熒光強度，HE染色觀察神經元病理形態變化。結果海馬神經元純度超過95%。與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；LDH漏出率明顯升高（P ＜0.01）；Ca2＋熒光強度明顯增強（P＜0.01）；神經元細胞數目明顯減少，突起萎縮甚至消失，部分細胞核固縮。與鋁負荷模型組比較，DP2激動劑DK-PGD2干預組MTT值明顯降低（P＜0.01、P＜0.05）；LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；Ca2＋熒光強度有增強趨勢，但差異無顯著性；海馬神經細胞幾乎全部核固縮、裂解。DP2拮抗劑CAY10471干預組MTT值明顯升高（P＜0.01）；LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）；Ca2＋熒光強度明顯減弱（P＜0.01）。海馬神經細胞胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少。結論 DP2激活表達可增加神經元對鋁鹽損傷的易感性。

關鍵詞：海馬神經元；鋁負荷；DP2；Ca2＋；DK-PGD2；CAY10471

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．012．html

鋁為地殼中含量最豐富的金屬元素，人類日常生活中應用廣泛，主要通過食物、化妝品及建筑材料等途徑攝入。經證實，長期攝入大劑量鋁會產生嚴重中樞神經系統毒性，表現為行為和認知功能障礙、神經元損傷，甚至神經退行性變，但其具體機制尚不完全清楚。

前列腺素（PGs）是一類多不飽和脂肪酸衍生物，由環氧化酶（COX）催化花生四烯酸（AA）代謝產生，介導一系列生理病理過程［1］。前列腺素D2（PGD2）是大腦中最豐富的PGs，其合酶（PGDS）有腦型PGDS（L-PGDS）和生血型PGDS（H-PGDS）兩種亞型［2］。在中樞神經系統，除少突膠質細胞外，L-PGDS高表達于神經元［3］。PGD2與特異性受體DP1和DP2結合后，通過受體介導的信號傳遞機制而發揮廣泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶聯受體，分別偶聯Gs和Gi蛋白，影響環磷酸腺苷（cAMP）水平而發揮不同作用。有研究報道，在PGD2致原代大鼠皮層神經元損傷模型中，DP2拮抗劑BAY-u3405未發揮保護作用，推測DP2可能不介導PGD2的神經毒性［4］。另也有研究報道，在谷氨酸致原代大鼠海馬腦片損傷模型中，DP2激動劑DK-PGD2明顯升高神經元的LDH漏出率及細胞死亡率，提示DP2介導PGD2的神經毒性［5］。出現此矛盾結果，可能與研究模型不同有關。DP2作為DP受體中的一員，在鋁鹽致原代培養大鼠海馬神經元損傷過程中具體是如何變化的，尚未見報道。目前廣泛研究的DP2選擇性激動劑主要有DK-PGD2、15d-PGD2、15d-PGJ2，DP2選擇性拮抗劑主要有CAY10471、AM-461、AZD1981。參考Yue等［6］的報道，我們選擇DK-PGD2、CAY10471作為干預藥物進行實驗。

我們前期實驗結果表明，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷模型中，L-PGDS表達明顯上調，DP2表達明顯下調，PGD2含量明顯升高，初步提示L-PGDS-PGD2-DP2信號通路可能參與了神經元損傷過程。在本實驗中，我們采用DP2選擇性激動劑和拮抗劑分別干預鋁負荷神經元，進一步觀察DP2在原代培養大鼠海馬神經元中的作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物 選取孕期18 d左右的SD大鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證書號：SCXK（渝）2012－0002。

1．1．2主要試劑與儀器 麥芽酚（阿拉丁，上海），DMEM／F12、D-Hank′s（Hyclone，美國），B27、Neuro-basal培養基、胎牛血清（Gibco，美國），左旋多聚賴氨酸、MTT試劑盒（Sigma，美國），青霉素－鏈霉素溶液、LDH試劑盒、Fluo-3 AM（碧云天，上海），山羊抗兔特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（博士德，武漢），SP試劑盒、DAB顯色劑（中杉金橋，北京），蘇木精染液、伊紅染液（南京建成，南京），DK-PGD2、CAY10471（Cayman，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），二氧化碳培養箱（Thermo Sci-entific，美國），超純水系統（Millipore，美國），低溫冷凍離心機（Thermo Scientific，美國），激光掃描共聚焦顯微鏡（Bio-Rad，美國），全自動酶標儀（BioTek，美國）。

1．2方法

1．2．1大鼠海馬神經元原代培養 取孕期18 d左右的SD大鼠，斷頸后迅速剪開腹部皮膚和腹膜，將子宮完全暴露后剪斷肌層和臍帶，取出胎鼠并立即浸泡于裝有75%乙醇的燒杯中。約30 s后，將消毒好的胎鼠移入事先準備的D-Hanks液中，斷頭取腦，迅速分離出兩側完整海馬，放入冰浴的D-Hanks液中，用眼科剪將海馬組織剪碎。加入組織體積5倍左右的0.125%胰酶，混勻，37℃培養箱內消化，10 min時拿出輕輕吹打數次。20 min后，加入同體積的含10%胎牛血清培養液終止消化。200目細胞網篩過濾，收集細胞懸液，800 r·min－1離心10 min。棄去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培養液重懸細胞，制成細胞密度為1×106·L－1的細胞懸液。吸取不同體積細胞懸液分別接種于左旋多聚賴氨酸包被好的培養板、培養皿及培養瓶中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。4 h后，待神經元貼壁，換含2%B27的Neurobasal培養液繼續培養，以后每隔3 d半量換液1次。海馬神經元培養至d 7時長到較好狀態，可進行后續實驗［7］。

1．2．2原代培養大鼠海馬神經元的免疫化學鑒定

取6孔培養板中培養至d 7的海馬神經元爬片（10 mm×10 mm），棄去細胞培養液用PBS漂洗3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，每次2 min；3%H2O2孵育15 min，PBS漂洗3次，每次2 min；10%山羊血清封閉，37℃孵育20 min，吸干血清，不漂洗；NSE多克隆抗體∶抗體稀釋液（1∶50），以PBS代替一抗設空白對照，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min；生物素標記山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素工作液，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；避光條件下，DAB顯色10 min，自來水終止反應；蘇木精染液復染細胞核，3 min后自來水返藍；95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；晾干，鏡下觀察［8］。

1．2．3MTT測定 將96孔培養板中大鼠海馬神經元培養至d 7進行實驗分組，即空白對照組（300 μmol·L－1maltol）、鋁負荷模型組［100 μmol·L－1Al（malt）3］、干預組（Al3＋＋10－5、3×10－6、10－6mol ·L－1DK-PGD2、CAY10471）。在加入處理因素后繼續培養24 h，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 g· L－1），37℃培養箱中孵育4 h。棄去孔內上清液，加入150 μL DMSO，搖床上避光震蕩，以充分溶解結晶物，于570 nm波長處測定吸光度值（OD值）。

1．2．4乳酸脫氫酶（LDH）漏出率測定 將24孔培養板中大鼠海馬神經元培養至d 7進行實驗藥物處理（分組同“1．2．3”），繼續培養24 h后，根據LDH測定試劑盒說明書具體步驟操作，于490 nm波長處測定OD值。計算公式：細胞毒性或LDH漏出率／%＝（處理樣品OD值－樣品對照孔OD值）／（細胞最大酶活性的OD值－樣品對照孔OD值）×100。

1．2．5海馬神經元病理形態學觀察 將24孔培養板中大鼠海馬神經元爬片（10 mm×10 mm）培養至d 7進行實驗分組，即空白對照組（300 μmol·L－1mal-tol）、鋁負荷模型組［100 μmol·L－1Al（malt）3］、干預組（Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2、CAY10471）。在加入處理因素后繼續培養24 h，棄去細胞培養液，PBS漂洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；HE染色，鏡下觀察。

1．2．6Ca2＋熒光強度測定 將共聚焦專用培養皿中大鼠海馬神經元培養至d 7進行藥物處理（分組同“1．2．5”），繼續培養24 h。棄去培養皿中培養液，采用Ca2＋熒光探針Fluo-3／AM標記活細胞內Ca2＋，通過激光掃描共聚焦顯微鏡測定細胞內Ca2＋熒光強度。

2　結果

2．1原代培養大鼠海馬神經元NSE免疫化學鑒定

培養至d 7的神經元，在倒置光學顯微鏡下觀察，其胞體飽滿有光暈，軸突和樹突明顯，突起交錯連接成網狀。經NSE免疫細胞化學染色后，陽性細胞胞體及突起呈棕黃色；蘇木精復染后，陽性細胞胞核呈藍色。隨機取6個視野，每個視野挑選100個細胞，計數NSE陽性細胞并計算其所占百分比。統計結果顯示，超過95%為陽性細胞（Fig 1）。

Fig 1 NSE expression in primary cultured rat hippocampal neuron by immunocytochemistry

2．2DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響

2．2．1DK-PGD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；與鋁負荷模型組比較，DK-PGD2干預組MTT值明顯降低，且有劑量依賴性（Tab 1）。

Tab 1 Effects of DK-PGD2on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 1 Effects of DK-PGD2on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；*P＜0.05，**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group OD Control　0．63±0．02 100 μmol·L－1Al（malt）3　0．40±0．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　0．21±0．01**Al3＋＋3×10－6mol·L－1DK-PGD2　0．25±0．02**Al3＋＋10－6mol·L－1DK-PGD2　0．33±0．02*

2．2．2CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組MTT值明顯升高，且有劑量依賴性（Tab 2）。

2．3DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響

Tab 2 Effects of CAY10471 on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 2 Effects of CAY10471 on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group OD Control　0．85±0．03 100 μmol·L－1Al（malt）3　0．51±0．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　0．76±0．04**Al3＋＋3×10－6mol·L－1CAY10471　0．67±0．04**Al3＋＋10－6mol·L－1CAY10471　0．58±0．04**

2．3．1DK-PGD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；與鋁負荷模型組比較，DK-PGD2干預組LDH漏出率明顯升高，10－5mol·L－1、3×10－6mol·L－1組差異有顯著性（P＜0.01）（Tab 3）。

Tab 3 Effects of DK-PGD2on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 3 Effects of DK-PGD2on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　LDH leakage／% Control　4．03±0．34 100 μmol·L－1Al（malt）3　21．90±0．89＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　43．38±1．56**Al3＋＋3×10－6mol·L－1DK-PGD2　31．41±1．97**Al3＋＋10－6mol·L－1DK-PGD223．23±0．56

2．3．2CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）（Tab 4）。

Tab 4 Effects of CAY10471 on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 4 Effects of CAY10471 on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　LDH leakage／% Control　5．50±0．94 100 μmol·L－1Al（malt）3　35．19±2．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　7．40±1．36**Al3＋＋3×10－6mol·L－1CAY10471　20．63±1．41**Al3＋＋10－6mol·L－1CAY10471　27．68±1．51**

2．4DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元病理形態學的影響 HE染色后，在正置光學顯微鏡下觀察，空白對照組海馬神經元結構清晰完整，胞體呈錐形或三角形，核仁明顯，有雙極或多極突起并相互交織成網；鋁負荷模型組海馬神經元細胞數目明顯減少，突起萎縮，部分細胞核固縮；DK-PGD2干預組海馬神經細胞幾乎全部核固縮、裂解；CAY10471干預組海馬神經元較模型組神經元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少（Fig 2、3）。

Fig 2 Effects of DK-PGD2inter-vention on pathomorphology of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（×400）

Fig 3 Effects of CAY10471 in-tervention on pathomorphology of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum o-verload（×400）

2．5DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元Ca2＋熒光強度變化的影響 空白對照組海馬神經元的Ca2＋熒光強度極其微弱，鋁負荷模型組Ca2＋熒光強度明顯增強（P＜0.01）；與鋁負荷模型組比較，DK-PGD2干預組Ca2＋熒光強度有增強趨勢，但差異無顯著性；CAY10471干預組Ca2＋熒光強度明顯降低（P＜0.01）（Tab 5、Fig 4）。

Tab 5 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝10）

Tab 5 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝10）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　Fluorescence intensity Control　295．77±46．45 100 μmol·L－1Al（malt）3　2 039．90±138．26＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　2 219．96±138．10 Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　1 062．11±161．40**

3　討論

鋁作為一種公認的神經毒劑，過量蓄積可嚴重影響人的認知功能，進而誘發一系列神經系統疾病［9］。與三氯化鋁、葡萄糖酸鋁等其他鋁鹽相比，麥芽酚鋁［Al（malt）3］是一種中性含鋁復合物，在生理pH條件能釋放出大量Al3＋，有利于進行鋁負荷神經毒性的相關研究［10］。本實驗采用Neurobasal培養基（含2%B27）進行海馬神經元的原代培養，通過神經元胞質內特異性標志物NSE的鑒定，其純度超過95%。參考Chen等［11］并通過我們的前期實驗摸索，本實驗采用100 μmol·L－1麥芽酚鋁建立鋁負荷大鼠原代海馬神經元損傷模型。研究結果發現，與空白對照組比較，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2＋熒光強度明顯增強，海馬神經細胞數目明顯減少、突起萎縮，部分細胞核固縮。Chen等［12］對麥芽酚鋁致原代培養的大鼠皮層神經元損傷進行了研究，發現Al3＋通過激活Rho-Rock信號通路誘導神經毒性。Johnson等［13］在原代培養的大鼠海馬神經元中發現，麥芽酚鋁可造成神經元呈時間和劑量依賴性凋亡，其作用機制可能與麥芽酚鋁抑制腦源性神經生長因子（BDNF），導致細胞內Ca2＋升高有關。

Fig 4 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（×200）

我們實驗結果還發現，與鋁負荷模型組相比，DK-PGD2干預組MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2＋熒光強度有增強趨勢，海馬神經細胞幾乎全部核固縮、裂解；CAY10471干預組MTT值明顯升高、LDH漏出率明顯降低、Ca2＋熒光強度明顯減弱，海馬神經元較模型組神經元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少。有研究報道［14］，DP2偶聯Gi蛋白，通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），磷酸化絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Ser50／Thr145），激活糖原合成酶3（GSK-3），活化T細胞核因子的轉換，釋放炎性介質。也有研究報道［15］，DP2被激活后偶聯Gi蛋白，抑制cAMP水平，促進Ca2＋內流，上調CD11b表達，誘導嗜堿性粒細胞遷移和脫顆粒，促進IL-2、IL-4、IL-5、IL-13的釋放。Liang等［5］對天冬氨酸（NMDA）致原代海馬神經元損傷進行了研究，發現DK-PGD2加重神經元損傷。Schroder等［16］對炎性相關因子前列腺素H1（PGH1）進行了研究，發現CAY10471可抑制Th2細胞的遷移。結合本實驗結果，DK-PGD2可能通過激動DP2，偶聯Gi蛋白，增加細胞內Ca2＋濃度，加重鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷；CAY10471可能通過抑制DP2活性，減少Ca2＋流入，對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經元損傷起一定保護作用。

綜上所述，DP2激活表達可增加神經元對鋁鹽損傷的易感性，其機制可能涉及DP2下游Ca2＋信號通路的調控，但由于作用復雜，在神經系統中的機制尚不完全清楚。因此，在本研究的基礎上，可對DP2在神經系統中介導的下游Ca2＋信號通路的具體調控機制進行深入研究。

（致謝：本實驗在重慶醫科大學生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，非常感謝實驗室提供的優越實驗條件，使得本實驗能順利完成。再次呈上我誠摯的謝意！）

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Effects of DP2intervention on primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload

YANG Qun-fang，WEI Yu-ling，YANG Jun-qing
（Dept of Pharmacology，Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To establish primary cultured rat hip-pocampal neuron damage model induced by aluminum maltolate and study the effect of intervention for DP2on primary cultured rat hippocampal neuron treated withbook=1076,ebook=45aluminum overload．Methods The hippocampus was dissected out from fetal rat（embryonic 18 d）．After being cultured for 7 d，the hippocampal neuron was treated with Al（malt）3to establish the model of prima-ry cultured rat hippocampal neuron damage and mean-while treated with DP2agonist DK-PGD2and DP2an-tagonist CAY10471，respectively．After treatment for 24 h，the cell viability was measured by MTT and LDH，Ca2＋fluorescence intensity．Neuronal pathomor-phology was observed by HE staining．Results The purity of hippocampal neuron was more than 95%．Compared with the control group，the number of hipp-ocampal neurons was reduced and neurons became chromatic agglutination and karyopyknosis in aluminum overload group．Treatment of aluminum caused a sig-nificant decrease in MTT value（P＜0.01）and an in- crease in the LDH leakage rate（P＜0.01）．The Ca2＋fluorescence intensity significantly increased（P＜0.01）in aluminum overload group．Compared with that of the aluminum overload group，treatment of DK-PGD2，a selective DP2agonist，significantly aggravated the primary cultured rat hippocampal neuron injury caused by aluminum overload accompanied with the significant decrease of MTT value（P＜0.01，P＜0.05）and an increase of the LDH leakage rate（P＜0.01），significant increase of Ca2＋fluorescence inten-sity of neuron．Treatment of CAY10471，a selective DP2antagonist，had opposite effects of DK-PGD2．Conclusion The activation of DP2can increase hipp-ocampal neural susceptibility to aluminum overload．

Key words：hippocampal neuron；aluminum overload；DP2；Ca2＋；DK-PGD2；CAY10471

作者簡介：陽群芳（1989－），女，碩士生，研究方向：神經精神藥理學，E-mail：yqfang0817＠163．com；楊俊卿（1968－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經精神藥理學，通訊作者，Tel：023-68485161，E-mail：qqqjy＠sohu．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81070972）

收稿日期：2015－03－11，修回日期：2015－04－14

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1071－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．009