3，5，2’，4’-四羥基查爾酮對尿酸誘導高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響研究

普菁瑩，牛艷芬，高麗輝，林 華，涂彩霞，李 玲

（昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，云南昆明 650500）

3，5，2’，4’-四羥基查爾酮對尿酸誘導高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響研究

普菁瑩，牛艷芬，高麗輝，林 華，涂彩霞，李 玲

（昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，云南昆明 650500）

中國圖書分類號：R-332；R322．61；R446．11；R589.9；R916.4

摘要：目的 研究3，5，2’，4’-四羥基查爾酮（P40）對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響，以及對尿酸腎臟轉運體葡萄糖轉運體9（GLUT9）、尿酸鹽轉運體1（URAT1）的調控作用。方法 昆明種小鼠60只，隨機分為正常組、模型組、P40 2．0、4．0、8．0 mg·kg－1組以及陽性對照組，分別灌胃給予受試藥物5次；腹腔注射尿酸（150 mg·kg－1）誘導成高尿酸血癥小鼠，磷鎢酸法測定血尿酸水平和肝尿酸含量；RT-PCR和Western blot檢測小鼠腎臟GLUT9、URAT1的表達。結果 ①P40（4.0、8.0 mg·kg－1）劑量組明顯降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05，0.01）；各實驗組肝尿酸含量降低，與正常組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。②P40各劑量組URAT1基因表達水平無明顯變化，蛋白表達水平有下降趨勢，但尚未達到統計學意義（P＞0.05）。P40（2.0、4.0、8.0 mg· kg－1）組GLUT9基因表達水平具有下調趨勢，但與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；P40（4.0、8.0 mg·kg－1）組GLUT9蛋白表達水平明顯下降，與模型組相比，差異有統計學意義。結論 P40具有促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機制與下調GLUT9的蛋白表達有關。

關鍵詞：3，5，2’，4’-四羥基查爾酮；高尿酸血癥小鼠；尿酸；GLUT9；URAT1；尿酸排泄

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．016．html

痛風（gout）是由于體內尿酸結晶沉積到軟組織，引發急、慢性炎癥和組織損傷，出現臨床癥狀和體征的一組臨床綜合征。通常認為高尿酸血癥是痛風最重要的生化基礎，據統計有5%～12%的高尿酸血癥最終可發展為痛風［1］。任何原因引起尿酸生成增多和（或）排泄減少均可導致高尿酸血癥，其中尿酸排泄減少約占原發性高尿酸血癥患者的90%［2］。腎臟在尿酸的排泄中占有重要地位，體內2／3的尿酸由腎臟排泄，經過腎小球濾過、腎小管重吸收、再分泌和再吸收而排出體外，其中腎小管對尿酸的重吸收是影響血尿酸水平的主要環節。近年的研究認為腎臟的尿酸轉運體URAT1／SLC22A12、GLUT9／SLC2A9參與了尿酸的重吸收。

3，5，2′，4′-四羥基查爾酮（C15H12O5，P40）（Fig 1）是中國科學院昆明植物所朱華結研究員課題組以3，5-二羥基苯甲酸為原料合成的查爾酮類化合物［3］。該類化合物存在于甘草、啤酒花、鐮形棘豆等藥用植物中，由于其分子結構有較大柔性，能與不同的受體結合，具有廣泛的生物活性［4］。本課題組前期研究發現P40具有較強的降尿酸作用，其機制與抑制黃嘌呤氧化酶／黃嘌呤脫氫酶（XOD／XDH）的活性有關［5－6］。然而，P40的化學結構不同于上市的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇和非布索坦，很可能存在新的作用機制和靶點。鑒于腎臟在尿酸排泄中的重要作用，本研究擬從腎臟尿酸排泄角度探討P40的降尿酸作用及其分子機制，為闡明P40的作用機制提供科學依據。

Fig 1 Structure of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone

1　材料

1．1實驗動物 昆明種小鼠，♂，體質量18～22 g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：［SCXK（川）2011－24］，自由飲食。

1．2主要材料與試劑 3，5，2’，4’-四羥基查爾酮：由中國科學院昆明植物所朱華結研究員課題組合成并提供，分子質量為272．25；苯溴馬隆：德國赫曼大藥廠生產，由昆山龍燈瑞迪制藥有限公司分裝；尿酸：購于Sigma公司；尿酸測定試劑盒：南京建成生物技術有限公司生產；URAT1抗體：購于Protein公司；GLUT9抗體：購于Sigma公司；β-actin、山羊抗兔IgG／辣根酶標記：Abmart公司。

1．3儀器 全波長酶標儀：Molecular Devices公司，型號：SPECTRA MAX190；電熱恒溫水浴箱：北京長風公司，型號：HH·W21；高速冷凍離心機：HERM-LE公司，型號：Z300K；酶標板：美國Costar公司。

2　方法

2．1動物分組及給藥 選取標準體質量（18～22 g）♂昆明小鼠60只，隨機分為正常組、高尿酸血癥模型組、P40（2.0、4.0、8.0 mg·kg－1）劑量組、苯溴馬隆12.5 mg·kg－1組，各給藥組共灌胃給藥5次，每天兩次；腹腔注射尿酸150 mg·kg－13次誘導形成高尿酸血癥小鼠［7］，正常對照組則注射等體積溶媒。末次腹腔注射尿酸前40 min灌胃給予各受試藥物，給藥后1 h眶靜脈取血，3 000 r·min－1離心10 min，取血清；斷頸處死小鼠，迅速分離肝臟和腎臟，液氮凍存后于－80℃保存備測。磷鎢酸法測定小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量［8］。

2．2RT-PCR檢測腎臟URAT1、GLUT9基因表達水平 小鼠URAT1、GLUT9引物采用DNAMAN 6．0設計（Tab 1），經PubMed BLAST驗證后，由上海生工生物工程有限公司合成。每組隨機選取4例凍存的小鼠腎臟，提取總RNA后，ND-1000定量，并進行逆轉錄，隨后進行擴增。URAT1的擴增條件為：94℃2 min、94℃30 s、58℃35 s、72℃45 s、72℃10 min、4℃30 cycles，GLUT9的擴增條件為：94℃2 min、94℃30 s、57．7℃35 s、72℃45 s、72℃10 min、4℃30 cycles。電泳后的瓊脂糖凝膠用BIO-RAD凝膠成像系統進行凝膠成像，并對條帶進行灰度比值分析。

Tab 1 RT-PCR primer sequence

2．3Western blot檢測腎臟URAT1、GLUT9蛋白的表達水平 取凍存的小鼠腎臟，每組4例，組織裂解液提取小鼠腎臟組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白與上樣緩沖液的比例為1∶4，混勻后95℃10 min煮沸變性，進行SDS-PAGE電泳；濕法轉至PVDF膜；脫脂奶粉37℃搖床封閉膜2 h；4℃過夜孵育URAT1、GLUT9一抗（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）；TBST洗膜，室溫搖床孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）1 h；TBST洗膜，ECL化學發光。BIO-RAD系統成像，URAT1、GLUT9蛋白的相對表達量用URAT1、GLUT9與β-actin的光密度比值進行計算。

3　結果

3．1P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠血尿酸水平明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），提示模型復制成功；灌胃給予P40后，P40 （4.0、8.0 mg·kg－1）組及苯溴馬隆組血尿酸水平明顯下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），并呈現劑量－效應關系；與正常組比較，模型組及各給藥組肝尿酸水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；各給藥組的肝尿酸水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（Tab 2）。

Tab 2 Effects of P40 on uric acid levels in serum and liver in hyperuricemic mice（±s，n＝10）

Tab 2 Effects of P40 on uric acid levels in serum and liver in hyperuricemic mice（±s，n＝10）

＃＃P＜0．01 vs normal；*P＜0.05，**P＜0．01 vs model．

Group Dose／mg·kg－1 Uric acid Serum／μmol·L－1　Liver／μmol·g－1tissue Normal（CMC-Na）?。?86．77±20．52　4．97±0．37 Model（CMC-Na）?。?82．66±68．85＃?！?．85±0．59＃＃P40　2．0　346．31±46．88　4．10±0．46＃＃4．0　319．49±40．04*　4．09±0．82＃＃8．0　261．05±41．92**　3．76±0．26＃＃Benzbromarone　12．5　222．61±16．45**　4．03±0．34＃＃

3．2P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1基因、蛋白表達水平的影響 由Fig 2可看出小鼠腎臟URAT1基因表達水平無變化。模型組URAT1蛋白表達上調，與正常組相比，差異具有統計學意義；P40各系列給藥組UART1蛋白表達均有下調趨勢，但與模型組相比，差異無統計學意義；苯溴馬隆組下調URAT1蛋白表達，與模型組相比，差異具有統計學意義。

3．3P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9基因、蛋白表達水平的影響 由Fig 3可見，模型組GLUT9基因表達有上調趨勢，但與正常組相比，無統計學意義；P40各給藥組以及苯溴馬隆組其基因表達有下調趨勢，但與模型組相比，差異無統計學意義。模型組GLUT9的蛋白表達上調，與正常組相比，差異具有統計學意義；P40 4.0、8.0 mg· kg－1給藥組GLUT9蛋白表達下調，并呈現一定的劑量－效應關系，與模型組相比，差異具有統計學意義；而P40 2.0 mg·kg－1給藥組有下調GLUT9蛋白表達的趨勢，但與模型組相比，差異無統計學意義；苯溴馬隆組對其蛋白表達沒有影響。

4 討論

尿酸是人類嘌呤代謝的終末產物，由次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再在該酶的作用下進一步生成尿酸，而肝臟作為黃嘌呤氧化酶的高表達器官，是尿酸生成的主要場所，對機體尿酸的穩態起著重要的調節作用。體內生成70%的尿酸經由腎臟排泄。因此，增加體內尿酸、尿酸前體（次黃嘌呤、黃嘌呤）的量或抑制腎臟尿酸的排泄均可引起血尿酸水平的增高導致高尿酸血癥。本研究采用直接補充大劑量的外源性尿酸誘導形成高尿酸血癥小鼠［7，9］，在不影響小鼠自身尿酸生成的前提下，觀察P40對尿酸排泄的影響。結果表明P40劑量依賴性地降低了高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，與促尿酸排泄藥苯溴馬隆相似，提示P40具有促進尿酸排泄的作用。此外，在本實驗條件下，模型組及各用藥組的肝臟尿酸含量均低于正常組，提示大劑量的外源性尿酸進入機體后，有可能抑制了肝尿酸的生成。

Fig 2 Effects of P40 on renal mURAT1 mRNA and protein levels in hyperuricemic mice（±s，n＝4）

Fig 3 Effects of P40 on renal mGLUT9 mRNA and protein levels in hyperuricemic mice（±s，n＝4）

研究發現，腎小管上皮細胞頂端膜和基底膜上的多個轉運蛋白與尿酸的重吸收和分泌有關［10］，其中尿酸轉運體URAT1／SLC22A12［11］和GLUT9／SLC2A9［12］參與了尿酸的重吸收。URAT1和GLUT9分別表達于腎近端小管上皮細胞的頂端膜與基底膜，URAT1將尿酸從小管液中攝入小管細胞內，再經GLUT9泵出小管細胞基底膜，進入細胞間質和外周血管。URAT1基因突變將導致轉運體功能減退或喪失而表現出腎性低尿酸血癥，提示URAT1是影響血尿酸水平的一個重要的轉運蛋白［11］。苯溴馬隆即是以URAT1為靶點的促尿酸排泄藥，本實驗條件下也觀察到苯溴馬隆干預了該轉運體的蛋白表達，然而，P40則對高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1的基因、蛋白表達均無太大影響，初步提示P40促尿酸排泄作用的靶點并非URAT1。

GLUT9主要表達于腎臟和肝臟，雖然是葡萄糖轉運體家族成員之一，與GLUTs有相似的氨基酸序列，然而，其轉運葡萄糖和果糖的能力較低［13］。新近研究顯示GLUT9與尿酸的轉運密切相關，是一種高能尿酸轉運體。該轉運體以電壓依賴的方式將尿酸從小管細胞內轉運至細胞間質和外周血管中，它的轉運功能并不依賴于Na＋，而當細胞外K＋濃度升高時，其轉運功能增強，故又稱為電勢驅動尿酸轉運蛋白1（voltage driven urate transporter 1，URATv1）［14－15］。本實驗結果顯示P40明顯降低高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9蛋白的表達，而對GLUT9的mR-NA水平僅有下調趨勢，并未達到顯著統計學意義，說明P40主要干預了GLUT9蛋白的合成，而對基因的轉錄過程影響不明顯。此外，本研究顯示苯溴馬隆對GLUT9的mRNA和蛋白表達均無明顯影響，提示P40促進尿酸排泄的機制與苯溴馬隆不同，可能是通過下調GLUT9蛋白的表達，減少尿酸的重吸收而起到降尿酸的作用。

綜上所述，P40具有促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機制與下調GLUT9蛋白的表達有關。

（致謝：本實驗均在昆明醫科大學生物醫學工程研究中心完成。感謝該實驗室提供優良的實驗室環境以及先進的實驗設備，感謝云南省“孔祥復院士工作站”團隊給予的指導和幫助，讓該實驗得以順利完成。謝謝！）

參考文獻：

［1］ Rott K T，Agudelo C A．Gout［J］．J Am Med Assoc，2003，289 （21）：2857－60．

［2］ Pande I．An update on gout［J］．J Rheumatol，2006，1（2）：60 －5．

［3］ 廖頭根，汪秋安，安偉琴，等．新型查爾酮類化合物的合成及其生物活性研究［J］．有機化學，2006，26（5）：685－9．

［3］ Liao T G，Wang Q A，An W Q，et al．Studies on the synthesis of novel chalcone and biological activity［J］．J Org Chem，2006，26 （5）：685－9．

［4］ Issaenko O A，Amerrik A Y．Chalcone-based small-molecule in-hibitors attenuate malignant phenotype via targeting deubiquitinat-ing enzymes［J］．Cell Cycle，2012，11（9）：1804－17．

［5］ Niu Y F，Zhu H J，Liu J，et al．3，5，2’，4’-tetrahydroxychal-cone，a new non-purine xanthine oxidase inhibitor［J］．Chem Biol Interact，2011，189（3）：161－6．

［6］ 牛艷芬，劉 愷，高麗輝，等．P40對氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠尿酸水平及肝臟黃嘌呤氧化還原酶的影響［J］．中國藥學雜志，2015，50（1）：34－8．

［6］ Niu Y F，Liu K，Gao L H，et al．Effects of 3，5，2′，4′-tetra-hydroxychalcone on serum uric acid levels and the content of he-patic XOD／XDH in mice［J］．Chin Pharm J，2015，50（1）：34 －8．

［7］ 陳光亮，孫秀霞，王欽茂，等．小鼠高尿酸血癥模型的研究［J］．中國藥理學通報，2001，17（3）：350－2．

［7］ Chen G L，Sun X X，Wang Q M，et al．Studies on mouse hyperu-ricemia model［J］．Chin Pharmacol Bull，2001，17（3）：350－2．

［8］ 牛艷芬，高麗輝，李 玲，等．芒果苷對氧嗪酸鉀所致慢性高尿酸血癥大鼠尿酸及肝腎功能的影響［J］．中國藥理學通報，2012，28（11）：1578－81．

［8］ Niu Y F，Gao L H，Li L，et al．Effects of mangiferin on uric acid levels and the function of the liver／renal in oxonate-induced hype-ruricemic rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28（11）：1578－81．

［9］ 劉淑芬，曾學軍．高尿酸血癥動物模型研究進展［J］．基礎醫學與臨床，2011，31（3）：344－7．

［9］ Liu S F，Zeng X J．Advance in the research of animal models of hyperuricemia［J］．B＆C Med，2011，31（3）：344－7．

［10］Bobulescu I A，Moe O W．Renal transport of uric acid：evolving concepts and uncertainties［J］．Adv Chronic Kidney Dis，2012，19 （6）：358－71．

［11］Enomoto A，Kimura H，Chairoungdua A，et al．Molecular identi-fication of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels［J］．Nature，2002，417（6887）：447－52．

［12］Matsuo H，Chiba T，Nagamori S，et al．Mutations in glucose transporter 9 gene SLC2A9 cause renal hypouricemia［J］．Am J Hum Genet，2008，83（6）：744－51．

［13］Bibert S，Hess S K，Firsov D，et al．Mouse GLUT9：evidences for a urate uniporter［J］．Am J Physiol-Renal，2009，297（3）：F612 －9．

［14］Caulfield M J，Munroe P B，O’Neill D，et al．SLC2A9 is a high-capacity urate transporter in humans［J］．PLoS Med，2008，5 （10）：e197．

［15］Anzain N，Ichida K，Jutabha P，et al．Plasma urate level is di-rectly regulated by a voltage-driven urate efflux transporter URATv1（SLC2A9）in humans［J］．J Biol Chem，2008，283 （40）：26834－8．

Effects of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone on urate excretion in hyperuricemic mice

PU Jing-ying，NIU Yan-fen，GAO Li-hui，LIN Hua，TU Cai-xia，LI Ling
（Biomedical Engineering Research Center，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone（P40）on urate excretion，as well as mRNA and protein expressions of renal URAT1 and GLUT9 in hyperuricemic mice．Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into six groups：normal control group，hyperuricemic group（model group），P40 2．0，4．0，8．0 mg·kg－1groups and positive control group．All drugs were administered in-tragastrically to mice for 5 doses．Hyperuricemic mice were induced by intraperitoneal injection of uric acid （0．15 g·kg－1body weight）for 3 times．The urate levels were assayed with the phosphotungstic acid method．The mRNA and protein expressions of GLUT9 and URAT1 were determined by RT-PCR and Western blot．Results P40 at a dose of 4．0 and 8．0 mg· kg－1significantly reduced the serum urate levels in a dose-dependent manner，when compared with untreat-ed hyperuricemic mice（P＜0.05 or 0.01）．The he-patic urate contents decreased in untreated-and treated-hyperuricemic mice as compared with normal mice（P ＜0.01）．Furthermore，P40 had no influence on the renal URAT1 mRNA and protein expression levels，while it could down-regulate renal GLUT9 protein ex-pression but not mRNA expression in hyperuricemic mice．Conclusion P40 possesses potent uricosuric effects associated with urate reabsorption by down-regu-lating the protein expression of GLUT9 in kidney．

Key words：3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone；hype-ruricemic mice；uric acid；GLUT9；URAT1；urate ex-cretion

作者簡介：普菁瑩（1990－），女，碩士生，研究方向：內分泌代謝藥理學，E-mail：381561758＠qq．com；李 玲（1962－），女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：內分泌代謝藥理學，通訊作者，Tel：0871-65922743，E-mail：kmli62＠aliyun．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81260503，81360505）；云南省應用基礎研究計劃項目（No 2012FB020，2013FZ076，2013Z112）

收稿日期：2015－04－20，修回日期：2015－05－27

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1091－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．013