黃芪甲苷對Ⅰ型糖尿病大鼠心肌細胞PGC-1α 和NRF-1表達的影響

曹瓊丹，楊育紅，于勝男，魯美麗，張素萍，韓镕徽，胡 進

（遼寧醫學院心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧錦州 121001）

黃芪甲苷對Ⅰ型糖尿病大鼠心肌細胞PGC-1α 和NRF-1表達的影響

曹瓊丹，楊育紅，于勝男，魯美麗，張素萍，韓镕徽，胡 進

（遼寧醫學院心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧錦州 121001）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R329．24；R329.411；R587.102.2

摘要：目的 探討黃芪甲苷（ASIV）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠心肌細胞能量代謝及線粒體合成的影響。方法 50只6周齡的SD大鼠，分為5組，每組10只，分別是空白組、模型組、ASIV 10、20、40 mg·kg－1組。除空白組，其余40只尾靜脈注射STZ（35 mg·kg－1）建立Ⅰ型糖尿病心肌病模型。連續給藥16周后，檢測其左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張期末壓（LVEDP）、左心室最大上升／下降速率（±dp／dtmax），蘇木精－伊紅（HE）染色觀察心肌病理切片。ELISA檢測心肌組織中ATP、ADP、AMP的含量。Western blot法檢測心肌組織中過氧化體增殖物激活型受體γ共激活因子1α（PGC-1α）和核呼吸因子（NRF-1）蛋白表達，RT-PCR檢測心肌組織中PGC-1α和NRF-1 mRNA的表達。結果 與空白組相比，模型組大鼠的LVEDP上升，LVSP、±dp／dtmax下降，ATP／ADP、ATP／AMP比值均下降。與模型組相比，黃芪甲苷低劑量組變化不明顯，中、高劑量組LV-EDP下降，LVSP、±dp／dtmax上升，ATP／ADP、ATP／AMP比值均上升，PGC-1α與NRF-1的蛋白表達和mRNA表達均增加，有一定的劑量依賴性。結論 黃芪甲苷通過提高PGC-1α和NRF-1的表達促進Ⅰ型糖尿病大鼠心肌細胞內線粒體的生物合成，提高能量代謝。

關鍵詞：黃芪甲苷；糖尿病心肌病；PGC-1α；NRF-1；線粒體；能量代謝

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．017．html

糖尿病是一種以高血糖為特征的內分泌代謝性疾病。Ⅰ型糖尿病病人胰島素分泌下降，致使體內葡萄糖大量堆積無法利用。心臟作為一個高耗能的器官，需要大量ATP維持其正常的運作，主要由線粒體提供。過氧化體增殖物激活型受體γ共激活因子1α（PGC-1α）是線粒體生成的關鍵調控因子［1－3］，可增強核受體及相關轉錄蛋白的轉錄活性，刺激線粒體合成和呼吸的發生［4］。近年來研究顯示，在多種糖尿病并發癥中發現了PGC-1α表達的下調［5］，同時影響下游的核呼吸因子NRF-1的表達，致使線粒體生物合成受損，線粒體功能障礙，這可能是糖尿病并發癥發病的重要機制之一。黃芪甲苷（ASIV）具有廣泛的藥理作用，對心肌細胞具有保護作用［6］。本實驗主要研究ASIV能否通過PGC-1α來提高糖尿病大鼠心肌細胞能量代謝，從而為糖尿病心肌病提供新的治療方案

1　材料與儀器

1．1藥物與試劑 黃芪甲苷（純度0.98，南京景竹生物科技有限公司），羧甲基纖維素鈉CMC、鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma公司），ATP、ADP、AMP ELISA試劑盒（R＆D公司），PGC-1α、NRF-1抗體（Abcam公司），TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒（北京鼎國），其他試劑均為國產分析純。

1．2動物 ♂Sprague-Dawley（SD）大鼠，6周齡，體質量（200±20）g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2009－0004。實驗室溫度（22±2）℃，濕度45%～65%，適宜通風，每天12 h光照，正常飲水、進食。

1．3儀器 BL-420四道生理記錄儀，成都泰盟科技有限公司；DNM-9602G酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司；Onetouch II血糖儀，美國強生公司；RM2235型石蠟切片機；Leica DM 1000光學顯微鏡，德國Leica公司；凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、PCR儀，美國Bio-Rad公司；核酸蛋白分析儀，德國Ep-pendorf公司。

2　方法

2．1糖尿病模型制備 用0.1 mol·L－1的枸櫞酸緩沖液（pH＝4.2）在冰浴中配制為10 g·L－1的STZ溶液，現配現用，禁食8 h后的大鼠尾靜脈注射STZ（35 mg·kg－1）。注射完7 d后空腹測血糖，若血糖大于16.7 mmol·L－1，且有多飲、多食、多尿現象者，確定為糖尿病大鼠。本實驗均造模成功。

2．2實驗動物分組與處理 隨機選擇10只健康♂SD大鼠作為空白組，40只造模成功的糖尿病大鼠隨機分為4組，分別為模型組、黃芪甲苷高、中、低劑量治療組。黃芪甲苷用1%的羧甲基纖維素鈉助溶。各治療組分別以每日40、20、10 mg·kg－1的ASIV劑量灌胃1次。空白組和模型組，每日以等體積1%羧甲基纖維素鈉灌胃1次。于給藥16周末，空腹8h后麻醉，右頸動脈插管測血流動力學指標，腹主動脈取血，開胸取心臟，一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色；另一部分凍存－80℃冰箱，用于RT-PCR和Western blot檢測。

2．3血流動力學測定 大鼠腹腔注射水合氯醛（45 mg·kg－1）麻醉后仰位固定，分離右側頸總動脈，由頸總動脈插管至左心室，采用BL-420四道生理記錄儀對左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張期末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大上升／下降速率（±dp／dtmax）進行記錄。

2．4心肌組織結構觀察 4%多聚甲醛固定心肌組織24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm石蠟切片，常規HE染色，中性樹脂封片，光鏡顯微鏡（×400）下觀察分析心肌組織病理變化。

2．5ELISA試劑盒檢測心肌組織ATP、AMP、ADP的含量 剪取體積約2 mm3的心肌組織，加入1 mL RIPA裂解液，勻漿器勻漿后，4℃12 000 r· min－1離心10 min，取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，450 nm波長下檢測OD值，繪制標準曲線，計算各組心肌組織ATP、ADP、AMP含量，計算ATP／ADP、ATP／AMP的值。

2．6Western blot檢測PGC-1α和NRF-1蛋白表達 從－80℃冰箱取100 mg凍存的心肌組織，加入1 mL RIPA裂解液（含1 mmol·L－1的PMSF），快速勻漿后用超聲波粉碎儀粉碎30 s，冰上靜置30 min后，4℃16 000 r·min－1離心15 min，取上清。用BCA法進行蛋白含量測定，調整蛋白濃度至1 g ·L－1。根據所需樣品體積，加5×SDS上樣緩沖液，98℃加熱10 min，使蛋白變性。灌膠上樣進行SDS-PAGE電泳。取出凝膠轉移至PVDF膜，封閉，加入一抗4℃孵育，過夜。加入二抗，室溫孵育1 h，沖洗后，ECL顯色，定影。凝膠圖像處理系統分析目標條帶的分子量和凈光密度值。

2．7RT-PCR檢測PGC-1α和NRF-1 mRNA的表達 取凍存的心肌組織約100 mg，加1 mL TRIzol，按試劑盒操作，提取總RNA。用酶標儀鑒定RNA純度和濃度。每個樣品的上樣量為500 ng，按試劑盒說明書進行操作。引物序列如Tab 1所示。反轉錄，45℃，30 min；預變性，95℃，5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環；終延伸，72℃，5 min。取產物9 μL，加1 μL 10×上樣緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳40 min，在凝膠成像儀上照相觀察，對實驗結果進行分析處理。

Tab 1 Specific primer sequences for RT-PCR

2．8統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內兩兩比較采用LSD法。

3　結果

3．1血流動力學參數變化 由Tab 2可見，與空白組相比，模型組LVEDP明顯升高，而LVSP、±dp／dtmax明顯降低（P＜0.01），表示模型組大鼠心臟舒縮功能不全；與模型組相比，ASIV中、高劑量組對左心功能的改善效果明顯，LVSP、±dp／dtmax上升，LVEDP下降（P＜0.01），并存在劑量依賴性。而ASIV低劑量組改善心功能癥狀不明顯。

Tab 2 Effects of ASIV on hemodynamics in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

Tab 2 Effects of ASIV on hemodynamics in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

**P＜0．01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model group

Group　LVEDP／kPa　LVSP／kPa　＋dp／dtmax／kPa·s－1　　－dp／dtmax／kPa·s－1Control　0．78±0．10　15．43±1．21　353．61±21．65　292．08±15．89 Model　2．17±0．37**　8．86±1．13**　202．61±18．40**　158．32±14．71**ASIV 10 mg·kg－1　2．12±0．29　10．28±1．80＃　231．25±14．50＃　201．68±14．70＃＃ASIV 20 mg·kg－1　1．68±0．29＃＃　12．92±1．29＃＃　276．28±16．84＃＃　223．70±10．05＃＃ASIV 40 mg·kg－1　1．25±0．22＃＃　13．84±1．42＃＃　280．39±26．12＃＃　262．15±16．78＃＃

3．2心肌組織結構改變 在顯微鏡下觀察心肌組織HE染色切片，空白組心肌細胞排列整齊，形態清晰；模型組心肌細胞形態紊亂，結構模糊，有大量炎細胞浸潤；與模型組相比，治療組隨藥物劑量增大，細胞間隙逐漸減小，間質依次減少，排列較整齊，形態逐漸均勻（Fig 1）。

Fig 1 Groups of rats myocardial morphology observation（HE× 400）

3．3心肌組織中ATP／ADP、ATP／AMP比值變化

用ELISA法檢測心肌組織中ATP、ADP和AMP的含量，并求ATP／ADP、ATP／AMP比值。由Tab 3可見，與空白組相比，模型組ATP／ADP、ATP／AMP比值明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，治療組的ATP／ADP、ATP／AMP比值均上升，其中中、高劑量組的比值上升明顯（P＜0.01），且呈劑量依賴。說明黃芪甲苷能夠改善心肌能量代謝。

Tab 3 Effects of ASIV on ATP／ADP and ATP／AMP ratio in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

Tab 3 Effects of ASIV on ATP／ADP and ATP／AMP ratio in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

**P＜0．01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model group

Group　ATP／ADP　ATP／AMP Control　2．30±0．40　8．88±2．00 Model　0．43±0．25**　2．65±0．78**ASIV 10 mg·kg－1　0．76±0．24＃　3．95±1．42＃ASIV 20 mg·kg－1　1．03±0．25＃＃　4．22±0．99＃＃ASIV 40 mg·kg－1　1．55±0．23＃＃　5．54±1．36＃＃

3．4Western blot法檢測心肌組織中PGC-1α和NRF-1蛋白表達變化 與空白組相比，模型組PGC-1α和NRF-1蛋白的表達明顯降低；與模型組相比，ASIV低、中、高劑量組干預后，PGC-1α和NRF-1蛋白表達明顯升高，且呈劑量依賴性。說明黃芪甲苷可能通過PGC-1α這一路徑干預糖尿病心肌病的能量代謝，保護受損的心肌細胞（Fig 2）。

Fig 2 Effects of ASIV on PGC-1α and NRF-1 protein expressions in myocardial tissue of rats（±s，n＝10）

3．5RT-PCR法檢測心肌組織中PGC-1α和NRF-1 mRNA表達變化 如Fig 3所示，與空白組相比，模型組的PGC-1α和NRF-1 mRNA表達下降；與模型組比較，低、中、高治療組隨藥物劑量的提高，PGC-1α和NRF-1 mRNA表達逐漸增多，進一步說明黃芪甲苷可能通過PGC-1α途徑改善糖尿病大鼠的心肌組織，提高能量代謝，促進心肌細胞線粒體的生物合成。

4　討論

線粒體在細胞中至關重要，它是為細胞供能的主要場所，它參與細胞從生長到凋亡的整個能量代謝過程。當線粒體生成障礙時，會直接影響線粒體的功能狀態，而線粒體功能狀態又與心血管疾病的發生發展關系密切。線粒體的生物合成是由線粒體基因和細胞核基因共同作用的，由于線粒體自身合成相關蛋白的能力有限，故線粒體的生物合成主要依賴于核基因［7］。PGC-1α作為主要的輔激活因子，在線粒體生物合成的調控中起到中心作用［8］。在心肌組織中，含量豐富的PGC-1α能夠強烈刺激下游核轉錄因子如線粒體轉錄因子A（TFAM）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和核呼吸因子（NRFs）等［9］，影響線粒體的生成，參與能量代謝的調控［10］。其中NRFs是調控線粒體生物合成最主要的轉錄因子。NRFs家族包括NRF-1和NRF-2，其中NRF-1的作用更為重要［11］。PGC-1α可強烈誘導下游NRF-1的表達，促進NRF-1的基因轉錄［12］。核轉錄因子NRF-1可促進線粒體氧化磷酸化，轉錄調控呼吸酶相關的細胞核基因，影響線粒體基因組的復制、轉錄、相關蛋白的表達等［13］。

Fig 3 Effects of ASIV on PGC-1α and NRF-1 mRNA expressions in myocardial tissue of rats（±s，n＝10）

本實驗結果顯示，連續喂養16周的糖尿病大鼠，與空白組相比，LVEDP上升，LVSP下降，±dp／dtmax也下降，HE心肌病理切片顯示炎癥細胞浸潤聚集，心肌細胞結構紊亂，說明糖尿病大鼠存在明顯的心肌病變，糖尿病心肌病大鼠造模成功。ELISA法檢測ATP、AMP、ADP的含量，模型組大鼠ATP／AMP、ATP／ADP比值明顯下降，證明心肌細胞供能減少，推測糖尿病心肌病可能與線粒體合成受損有關。Western blot和RT-PCR結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠心肌細胞PGC-1α和NRF-1的蛋白表達和mRNA表達均減少。進一步驗證，在I型糖尿病中，PGC-1α、NRF-1與糖尿病大鼠心肌細胞中線粒體合成的內在聯系。在大鼠心肌組織中，PGC-1α、NRF-1的表達減弱，線粒體生物合成受阻，功能受損，ATP合成減少，能量供應不足，出現代謝障礙。

黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，可增強心肌收縮力，改善心肌能量代謝，抑制心室肥厚、心肌纖維化及心肌凋亡，保護血管內皮細胞，減輕血管張力，降血壓，對心血管的保護作用十分明顯［6］。本實驗室先前研究表明，黃芪甲苷可通過PGC-1α途徑提高能量代謝來改善異丙腎上腺素誘導的大鼠的心肌肥厚癥狀［14］。糖尿病心肌病作為糖尿病的主要致死原因之一，其治療藥物一直是人們的研究熱點。近年來，大量實驗證明黃芪甲苷可降低血糖、血脂，抗炎癥，抗氧化［15］，刺激胰島素的產生［16］，對糖尿病及其并發癥具有保護作用。而黃芪甲苷究竟是通過何種機制作用于糖尿病，目前尚不明確。本實驗結果顯示，與模型組相比，黃芪甲苷干預治療后，LVEDP、LVSP、±dp／dtmax等血流動力學指標，HE病理染色均有所改善，大鼠ATP／AMP、ATP／ADP比值上升，PGC-1α和NRF-1的蛋白表達和mRNA表達均增加。由實驗結果推測，黃芪甲苷可能通過PGC-1α路徑激活下游的重要作用靶點核呼吸因子NFR-1，而NRF-1又進一步活化TFAM等線粒體相關因子，從而促進線粒體的生物合成和能量代謝，保護心肌，改善心臟功能障礙。

本實驗表明，黃芪甲苷可通過PGC-1α路徑來調控線粒體的代謝與合成，改善糖尿病心肌病的癥狀，但黃芪甲苷對NRF-1下游的具體作用機制還需進一步探索。綜上所述，Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠心臟功能障礙，能量代謝調節能力下降，線粒體合成受阻，黃芪甲苷作為一種改善心肌癥狀的有效藥物，為臨床上治療糖尿病心肌病提供了新的思路。

（致謝：本實驗于遼寧醫學院心腦血管藥物研究重點實驗室完成，感謝該實驗室諸位老師的悉心指導和同學們的大力幫助。）

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Effect of astragaloside IV on expression of PGC-1α and NRF-1 in myocardial cells of typeⅠdiabetic rat

CAO Qiong-dan，YANG Yu-hong，YU Sheng-nan，LU Mei-li，ZHANG Su-ping，HAN Rong-hui，HU Jin
（Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Drug Research of Liaoning Province，Drug Research Institute，Liaoning Medical University，Jinzhou Liaoning 121001，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of astragalo-side IV（ASIV）on myocardial energy metabolism and mitochondrial biosynthesis in myocardial cells of dia-betic rats induced by streptozotocin（STZ）．Methods 50 SD rats at 6 weeks of age were assigned to 5 groups，10 for each group：control group，model group，ASIV 10 mg·kg－1·d－1group，ASIV 20 mg·kg－1·d－1group，ASIV 40 mg·kg－1·d－1group．Except the control group，the remaining 40 were used to estab-lish type 1 diabetes model by the tail vein injection ofbook=1101,ebook=70STZ（35 mg·kg－1）．At the end of 16 weeks of treat-ment，left ventricular systolic pressure（LVSP），left ventricular diastolic final pressure（LVEDP）and left ventricular maximum rising／falling rate（±dp／dtmax）were tested．Pathological section was observed by HE staining．ATP，ADP，AMP levels were detected by ELISA．The expressions of PGC-1α and NRF-1 protein were assessed by Western blot．The expressions of PGC-1α and NRF-1 mRNA were determined by RT-PCR．Results Compared with control group，model group markedly elevated LVEDP and decreased LVSP，±dp／dtmax，ATP／AMP and ATP／ADP ratio．Com- pared with model group，low-dose ASIV group did not change significantly，middle-dose ASIV group and high-dose ASIV group obviously decreased LVEDP，and im-proved LVSP，±dp／dtmax，ATP／ADP and ATP／AMP ratio．Meanwhile，the expressions of PGC-1α and NRF-1 protein and mRNA were increased in a dose-de-pendent manner．Conclusion ASIV could promote mitochondrial biosynthesis，improve energy metabolism in myocardial cells of type 1 diabetic rats by PGC-1α and NRF-1．

Key words：astragaloside IV；diabetic cardiomyopa-thy；PGC-1α；NRF-1；mitochondria；energy metabolism

作者簡介：曹瓊丹（1990－），女，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail：cobra1129＠163．com；楊育紅（1967－），女，博士，教授，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail：jzwangpeixun＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81374008）

收稿日期：2015－03－26，修回日期：2015－04－29

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1096－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．014