慢病毒介導的干擾ClC-3肝癌穩定細胞株的建立及其侵襲和遷移能力的改變

徐 彬，林嘉麟，施靜雯，王施思，余 杰

（1．廣東藥學院生命科學與生物制藥學院生物制藥系，2．廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

慢病毒介導的干擾ClC-3肝癌穩定細胞株的建立及其侵襲和遷移能力的改變

徐 彬1，2，林嘉麟1，施靜雯1，2，王施思1，余 杰1

（1．廣東藥學院生命科學與生物制藥學院生物制藥系，
2．廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

中國圖書分類號：R373．9；R394．2；R73-37；R735．702．2

摘要：目的 建立慢病毒介導的靶向干擾電壓門控氯通道3 （voltage-gated chloride channel 3，ClC-3）的穩定肝癌細胞株，并探討其侵襲和遷移能力的改變。方法 構建靶向ClC-3 的3個短發夾狀RNA（short-hairpin RNA，shRNA）慢病毒表達載體，293FT細胞包裝慢病毒并測定滴度。重組慢病毒感染肝癌細胞株MHCC97H，篩選穩定干擾細胞株。實時熒光定量PCR和Western blot檢測ClC-3 mRNA和蛋白的表達以確定干擾效率。Transwell小室實驗（含Matrigel和不含Ma-trigel）和細胞劃痕實驗檢測ClC-3基因被抑制后侵襲和遷移能力的改變。結果 成功獲得4種慢病毒，感染MHCC97細胞后，建立1株陰性對照細胞和3株ClC-3穩定干擾細胞（MHCC97H／shClC-3-1、shClC-3-2和shClC-3-3）。3株穩定干擾細胞ClC-3 mRNA和蛋白表達水平明顯低于陰性對照細胞（P＜0.01），MHCC97H／shClC-3-2細胞對ClC-3的抑制效果最好。與陰性對照細胞相比，MHCC97H／shClC-3-2細胞侵襲和遷移能力都下降（P＜0.01）。結論成功建立穩定干擾ClC-3基因的肝癌細胞株，ClC-3表達抑制會降低MH-CC97H細胞的侵襲和遷移能力。

關鍵詞：電壓門控氯通道3；肝癌細胞；慢病毒載體；RNA干擾；穩定細胞株；遷移；侵襲

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．018．html

電壓門控性氯通道3（voltage-gated chloride channel 3，ClC-3）是ClC家族成員之一，廣泛分布于腦、腎、肝、骨骼肌、心臟和胰腺等組織器官，主要定位在細胞膜和細胞質內的囊泡膜，生理功能目前尚未完全清楚，可能通過容積激活性氯電流參與細胞容積的調節，從而參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程［1］。ClC-3在某些疾病的發生發展中也有重要作用，可能通過調控心肌細胞容積及活性氯電流參與心肌肥大的形成［2］，高表達可能參與了肺動脈高壓和肺動脈炎癥的機體適應性反應［3］，其缺失可能是腦海馬神經元退化的病因［4］。研究發現，在宮頸癌、肺癌、乳腺癌、膀胱移行細胞癌和人膠質瘤組織中ClC-3高表達［5－7］，采用氯通道阻斷劑可有效抑制乳腺癌細胞的增殖，應用ClC-3反義寡核苷酸可增強其抑制效果［8］。這些都提示ClC-3與腫瘤的關系非常密切，可能會在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用。轉移是大多數腫瘤患者死亡的原因，ClC-3是否參與腫瘤轉移過程更加值得研究和探討。本研究利用慢病毒介導的shRNA技術，轉導人高轉移肝癌細胞株MHCC97H，建立穩定干擾ClC-3基因的細胞株，并進一步觀察其體外侵襲和遷移能力的改變，為進一步研究ClC-3在腫瘤發生發展中的作用，以及以ClC-3為靶點的腫瘤治療的可行性奠定基礎。

1　材料與方法

1．1材料 高轉移人肝癌細胞MHCC97H、人胚腎細胞293FT、大腸桿菌stb13、慢病毒包裝系統PL-LU2G、pLV／helper-SL3、pLV／helper-SL4和pLV／helper-SL5由本實驗室保存，胎牛血清和RPMI 1640培養基購自Gibco公司，XhoⅠ、HpaⅠ內切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司，質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司，轉染試劑Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和熒光定量PCR試劑盒SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自廣州美津生物技術有限公司，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG均購自碧云天生物技術研究所，兔抗人ClC-3多克隆抗體購自Abcam公司，化學發光試劑購自Bio-Rad公司，Matrigel購自BD公司，Transwell小室購自Corning公司。

1．2方法

1．2．1干擾序列設計 在GenBank檢索出人ClC-3基因核苷酸序列（基因號NM＿001829），設計針對人ClC-3的3個干擾RNA序列（Tab 1）。正義與反義siRNA之間由6個堿基（CTCGAG）的loop環連接，上游鏈5′端加上一個T堿基，下游鏈5′端加上Xho I酶切粘端。同時設計1條無關序列作為陰性對照，作用序列為5′-GCTCTGGAGCAGTTCCGATAT-3′，通過BLAST驗證該序列對任何基因無干擾效應。Oligo DNA由上海英駿生物技術有限公司合成。

Tab 1 shRNA oligo sequences

1．2．2慢病毒表達載體的構建及鑒定 空載體PLLU2G含有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorecence protein，EGFP）序列，用限制性內切酶XhoⅠ和HpaⅠ雙酶切空載體，并回收酶切片段。上下游Oligo DNA經退火形成雙鏈DNA，然后與線性化后的空載體PLLU2G在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜連接，連接產物轉化感受態細胞stb13。37℃培養16 h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，PCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，序列為pLLU2G-flank-F：5′-AGGCTTAATGTGCGATAAAAG AC-3′，pLLU2G-flank-R：5′-GAGCTTATCGATACC GTCGAC-3′，空載體質粒會擴增出239 bp的片段，插入shRNA序列的質粒會擴增出302 bp的片段。PCR鑒定陽性的菌落接種LB液體培養基中培養過夜，提取質粒送測序。經測序鑒定正確的重組質粒分別命名為PLLU2G-shClC-3-1、PLLU2G-shClC-3-2、PLLU2G-shClC-3-3、PLLU2G-shControl。

1．2．3慢病毒包裝 收集對數生長期的293FT細胞，接種5×106個于10 cm的培養皿中，37℃、5% CO2的培養箱中培養過夜。按照說明書用脂質體進行共轉染：將輔助質粒pLV／helper-SL3、pLV／helper-SL4、pLV／helper-SL5和目的質粒各4 μg與40 μL Lipofectamine 2000用3 mL的無血清Opti-MEM?I培養液制備成DNA-脂質體復合物，滴加到293FT細胞中。分別收集轉染后48 h和72 h的上清液，用0.45 μm濾器進行過濾，濾液經超速離心后濃縮，分裝，保存于－80℃。PLLU2G-shClC-3-1、PLLU2G-shClC-3-2、PLLU2G-shClC-3-3和PLLU2G-shControl經包裝后獲得的慢病毒分別命名為Lenti-shClC-3-1、Lenti-shClC-3-2、Lenti-shClC-3-3和Lenti-shCon-trol。

1．2．4病毒滴度測定 滴度測定采用逐孔稀釋法，測定前1 d將5×107·L－1的293FT細胞按每孔100 μL接種于96孔板中，常規培養24 h。準備10個無菌的EP管，每個管中加入90 μL培養基，取病毒原液10 μL加入到第1個管中，混勻后，取10μL加入到第2個管中，如此依次做10∶1倍比稀釋。選取96孔板中所需的細胞孔，吸去90 μL培養基，加入稀釋好的病毒溶液，37℃培養48 h后，加入新鮮培養基100 μL繼續培養。96 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，計數孔中熒光細胞數，結合稀釋倍數計算病毒滴度：滴度（TU／ml）＝熒光細胞數×有效稀釋倍數。

1．2．5 穩定干擾細胞株的建立 感染前1 d取對數生長期狀態良好的MHCC97H細胞按每孔5×105個接種于6孔板。感染時，按照MOI＝100稀釋慢病毒，孔中分別加入含8 mg·L－1聚凝胺的4種稀釋后病毒液1 mL，同時設定空白的靶細胞作為對照。培養16 h后，更換為新鮮RPMI 1640完全培養基2 mL繼續培養，48 h后熒光顯微鏡下觀察感染效率。將感染后的細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，按照每皿1 000個的密度接種于10 cm的培養皿，培養至形成單克隆細胞團，選擇單克隆細胞再一次進行克隆，然后挑取足夠數量單克隆細胞進行擴增培養，為下一步檢測作準備。得到的3株穩定干擾細胞分別命名為MHCC97H／shClC-3-1、MH-CC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shClC-3-3，陰性對照細胞命名為MHCC97H／shControl。

1．2．6定量PCR檢測細胞ClC-3 mRNA干擾效率收集MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2、MHCC97H／shClC-3-3和MHCC97H／shControl細胞，按TRIzol試劑和反轉錄試劑盒說明書提供的方法提取細胞總RNA，并將其反轉錄為cDNA。以此cDNA為模板，應用熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，ClC-3和GAPDH基因（內參照）引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。ClC-3：5′-GGTTC-CATCAGGCTTGTTCATCC-3′（上游），5′-CCGACCT-CACACCACTCCTTAAAG-3′（下游）；GAPDH：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′（上游），5′-AC-CACCCTGTTGCTGTAGCC-3′（下游）。PCR反應條件：95℃60s；95℃15s、60℃1 min，共40個循環。以2－ΔΔCt值表示ClC-3基因mRNA的相對表達水平。

1．2．7Western blot檢測細胞ClC-3蛋白干擾效率收集MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2、MHCC97H／shClC-3-3和MHCC97H／shControl細胞，加入細胞裂解液冰上裂解10 min，取蛋白上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度。取50～80 μg蛋白質進行10%SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白質電轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h；加入1∶1 000稀釋的兔抗人ClC-3多克隆抗體和1∶2 000稀釋的小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4℃反應過夜；TBS洗膜后，分別加入1∶2 000稀釋的二抗（HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG），室溫反應2 h；TBS洗滌后，加入化學發光試劑，X線膠片曝光、顯影和定影。掃描膠片，對各蛋白條帶進行灰度值分析，以ClC-3蛋白條帶灰度值與內參照GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示ClC-3蛋白的相對表達水平。

1．2．8Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 進行侵襲實驗時，Transwell小室濾膜（孔徑8 μm）外表面涂纖粘連蛋白5 μg，內表面涂Matrigel基質膠5 μg；24孔板內加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，將Transwell小室浸入24孔板中。用無血清RPMI 1640培養基重懸MH-CC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shControl細胞，將1 ×109·L－1的細胞懸液按每小室100 μL加到小室中，孵育6 h。取出Transwell小室，濾膜用甲醇固定1 min，HE染色，擦去濾膜內表面未穿過的細胞。于顯微鏡下（200×）計數穿過濾膜的細胞數。每膜計數上下左右中5個隨機不同視野，每組設4個樣本。細胞遷移實驗與侵襲實驗相似，只是濾膜內表面不涂Matrigel。

1．2．9細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集MHCC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shControl細胞，按5×108·L－1接種2 mL于6孔板中，培養過夜至形成單細胞層。用10 μL吸頭在單細胞層上劃痕，然后用PBS清洗3次去除劃下的細胞。細胞加入無血清，含0.05 mg·L－1表皮細胞生長因子的RP-MI 1640培養基繼續培養48 h，在不同時間點下拍照，測量劃痕閉合寬度。

1．2．10統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，兩組間數據的比較采用t檢驗，多組間數據的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結果

2．1重組慢病毒質粒的PCR和測序鑒定 PCR

鑒定重組慢病毒質粒時，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為302 bp，而空載體克隆PCR片段大小為239 bp。將PCR產物進行電泳，第1對靶點序列結果顯示2＃、5＃和6＃克隆為陽性克隆，第2對靶點序列結果顯示1＃、2＃、3＃、4＃、6＃、7＃和8＃為陽性克隆，第3對靶點序列結果顯示3＃、5＃、6＃、7＃和8＃為陽性克隆（Fig 1）。從每個靶點序列的陽性克隆中各選一個進行測序，結果顯示序列均正確。

2．2慢病毒包裝、滴度測定和感染后MHCC97H細胞形態觀察 4質粒共轉染48 h，熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光產生，大部分細胞破裂釋放病毒，證實慢病毒包裝成功（Fig 2A）。將病毒進行濃縮后，用逐孔稀釋法測得Lenti-shClC-3-1、Lenti-shClC-3-2、Lenti-shClC-3-3和Lenti-shControl 4種病毒的滴度分別是7.0×1011TU·L－1、6.3×1011TU ·L－1、7．2×1011TU·L－1和8.3×1011TU·L－1。用4種慢病毒分別感染MHCC97H細胞后，都可觀察到綠色熒光，感染率達到100%（Fig 2B）。

Fig 1 Identification of recombinant lentiviral vectors with PCR

Fig 2 Packaging lentiviruses in 293FT cells and MHCC97H cells after infected with the recombinant lentiviruses under fluorescence microscope（200×）

2．3穩定干擾細胞株ClC-3 mRNA和蛋白干擾效率檢測 實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果顯示，3株穩定干擾細胞ClC-3 mRNA和蛋白的相對表達水平都明顯低于MHCC97H／shControl細胞。MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2和MH-CC97H／shClC-3-3的ClC-3 mRNA干擾率分別是（76.70±4.28）%、（89.46±2.37）和（58.12± 5.29）%（Fig 3A），ClC-3蛋白干擾率分別是（81.44 ±5.48）%、（92.14±5.92）%和（70.55±4.85）% （Fig 3B），差異有統計學意義（P＜0.01）。MH-CC97H／shClC-3-2細胞干擾效果最好，后續實驗選用它作為細胞模型進行功能性研究。

2．4穩定干擾細胞株侵襲和遷移能力的改變 采用Transwell小室檢測穩定干擾細胞株MHCC97H／shClC-3-2侵襲和遷移能力的變化（Fig 4）。細胞侵襲實驗中，MHCC97H／shControl和MHCC97H／shClC-3-2細胞中穿膜的細胞數分別為（181±13）和（105±11），MHCC97H／shClC-3-2細胞的穿膜數明顯減少（P＜0.01）；細胞遷移實驗中，MHCC97H／shControl和MHCC97H／shClC-3-2細胞穿膜的細胞數分別為（372±19）和（189±14），MHCC97H／shClC-3-2細胞的數量也同樣明顯減少（P＜0.01）。結果表明干擾ClC-3可抑制MHCC97H細胞的侵襲和遷移。

Fig 3 Detection of ClC-3 interference efficiency（±s，n＝4）

在細胞劃痕實驗中，細胞劃痕后采用無血清培養基能排除細胞增殖的影響。結果顯示MH-CC97H／shClC-3-2細胞的遷移能力明顯降低（Fig 5）。劃痕48 h后，MHCC97H／shControl細胞劃痕閉合率為100%，而MHCC97H／shClC-3-2細胞只有（60.35±5.76）%，明顯低于前者（P＜0.01）。

3　討論

Fig 4 Effect of ClC-3 interference on invasion and migration of MHCC97H cells detected by Transwell chamber assay（±s，n＝4）（200×）

Fig 5 Effect of ClC-3 interference on migration of MHCC97H cells detected by cell scratch assay（±s，n＝4）（200×）

ClC-3與腫瘤的發生和發展密切相關，可能參與了腫瘤細胞增殖、凋亡和耐藥等重要過程［9-11］。腫瘤細胞遷移能力增強通常提示其轉移能力增加，我們的前期研究中用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞中ClC-3的表達可使細胞遷移率下降［12］，提示ClC-3可能在腫瘤轉移過程中發揮了重要作用，但在后來的研究中發現此方法存在脫靶效應［13］。為了更深入地研究ClC-3在腫瘤侵襲轉移中的作用，需要更好的細胞模型，而肝癌轉移率很高，因此本研究采用人高轉移肝癌細胞MHCC97H作為研究細胞。

為了確定ClC-3是否參與了肝癌轉移，我們希望抑制MHCC97H細胞內源性ClC-3的表達來研究其對腫瘤的作用。目前，RNA干擾技術已成為研究基因功能的重要工具，但化學合成的siRNA存在轉染效率低、轉移到細胞內后半衰期短、對靶基因的表達抑制作用只能維持較短時間等缺陷［14］。而將shRNA載體導入細胞后，能在細胞內穩定地轉錄，并進一步生成靶基因特異性的siRNA，因此可以長期抑制靶基因表達的作用［15］。但普通shRNA僅可轉染分裂期細胞且轉染效率低。近年來發展的慢病毒技術，其免疫原性低、感染范圍廣，可整合到宿主細胞基因組穩定產生siRNA，高效抑制靶基因表達，而且可以濃縮，大大提高其轉染效率，使得慢病毒介導的shRNA干擾成為穩定基因沉默的最常用選擇［16］。本實驗依據RNA干擾技術設計了特異性靶向ClC-3基因不同位點的3條不同干擾shRNA，通過慢病毒的介導轉染MHCC97H細胞，經篩選獲得了穩定干擾ClC-3基因表達的3株細胞。干擾效率最好的MHCC97H／shCLC-3-2細胞，其ClC-3 mRNA抑制效率為89.46%，ClC-3蛋白抑制效率高達92.14%。我們的前期研究中，利用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞CNZ2Z的ClC-3表達，在mRNA和蛋白水平的抑制率最高分別為77.5%和74.1%［12］，這表明采用慢病毒介導的shRNA干擾技術來抑制ClC-3的表達是一種更好的研究方法。

腫瘤轉移是一個非常復雜的過程，腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力是腫瘤轉移的關鍵因素之一。本研究顯示，MHCC97H／shCLC-3-2細胞的穿膜能力在侵襲和遷移實驗中比MHCC97H／shControl細胞明顯降低，說明抑制ClC-3的表達可抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，提示ClC-3在肝癌細胞侵襲和遷移中發揮了重要作用。細胞劃痕實驗進一步證實，抑制ClC-3的表達可明顯抑制肝癌細胞遷移能力。非特異性ClC抑制劑NPPB可劑量依賴性的抑制子宮內膜癌細胞的侵襲和遷移［17］，用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞ClC-3的表達可明顯抑制其遷移能力［12］，因此推測，ClC-3可能在實體瘤中普遍具有促進腫瘤細胞侵襲和遷移的作用。Lui等［18］研究發現，NPPB可以完全抑制膠質瘤細胞的侵襲，但單獨使用ClC-3 siRNA和ClC-3抑制劑或聯合使用上述兩者卻都不能完全抑制細胞的侵襲，可見，可能有其他ClC家族成員在腫瘤細胞侵襲中也發揮了作用。但ClC-3是否參與了腫瘤的體內轉移過程以及調控腫瘤細胞侵襲和遷移的具體機制有哪些，值得進一步的深入研究。

綜上所述，我們應用慢病毒介導的shRNA干擾技術成功建立了穩定抑制ClC-3基因表達的肝癌細胞株，ClC-3表達抑制明顯降低肝癌細胞MHCC97H的侵襲和遷移能力，但其具體的調控機制還有待進一步研究。

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Establishment of a hepatic carcinoma cell line with stable ClC-3 silencing by lentivirus-mediated RNA interference and its influence on invasion and migration

XU Bin1，2，LIN Jia-lin1，SHI Jing-wen1，2，WANG Shi-si1，YU Jie1
（1．Dept of Biopharmaceutics，School of Biosciences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2．Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates，Guangzhou 510006，China）

Abstract：Aim To establish a hepatic carcinoma cell line with stable voltage-gated chloride channel 3（ClC-3）gene silencing through the lentivirus-mediated short-hairpin RNA（shRNA）method and investigate the effects of gene silencing on invasion and migration．Methods Three lentiviral vectors coding shRNA tar-geting ClC-3 gene were constructed，the recombinant plasmids were packaged into mature lentivirus by 293FT cells，and then the lentiviruses were harvested，concentrated and titrated．MHCC97H cells were infec-ted with the recombinant lentiviruses and then were se-lected to obtain cell lines stably expressing ClC-3 shR-NA．The efficiency of ClC-3 mRNA and protein ex-pression interference were determined by real-time flu-orescence quantitative PCR and Western blot，respec-tively．The effects of ClC-3 gene interference on inva-sion and migration of MHCC97H cells were performed by Transwell chamber assays with or without Matrigel and cell scratch assay．Results The recombinant lentiviral vectors were successfully constructed and four lentiviruses were acquired after packaged by 293FT cells．One negative control cell line and three cell lines with ClC-3 gene interference（MHCC97H／shClC-3-1，shClC-3-2 and shClC-3-3）were successfully construc-ted after MHCC97H cells were infected with lentivirus-es．The expression level of ClC-3 mRNA and protein in three ClC-3-silenced cells were obviously lower than the negative control cells（P＜0.01），MHCC97H／shClC-3-2 cells showed the greatest inhibition of ClC-3 mRNA and protein expressions．As compared with the negative control cells，the ClC-3 gene interference sig-nificantly decreased invasion and migration of MH-CC97H cells in vitro（P＜0.01）．Conclusion The hepatic carcinoma cell lines with stable ClC-3 gene si-lencing were successfully established and the ClC-3 gene interference could significantly inhibit invasion and migration of MHCC97H cells．

Key words：voltage-gated chloride channel 3；hepatic carcinoma cells；lentiviral vector；RNA interference；stable cell line；migration；invasion

作者簡介：徐 彬（1975－），女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：離子通道蛋白功能及靶向藥物篩選，通訊作者，Tel：020-39352151，E-mail：xubin2003＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31371144，81101666）

收稿日期：2015－05－07，修回日期：2015－06－08

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1101－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．015